научная статья по теме ПРЕДРАДИАЦИОННАЯ ИНДУКЦИЯ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА ПОВЫШАЕТ КЛЕТОЧНУЮ РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ Биология

Текст научной статьи на тему «ПРЕДРАДИАЦИОННАЯ ИНДУКЦИЯ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА ПОВЫШАЕТ КЛЕТОЧНУЮ РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ»

РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2007, том 47, № 3, с. 273-279

МОДИФИКАЦИЯ РАДИАЦИОННЫХ ЭФФЕКТОВ

УДК [577.2+576]:539.1.04:612.59

ПРЕДРАДИАЦИОННАЯ ИНДУКЦИЯ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА ПОВЫШАЕТ КЛЕТОЧНУЮ РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ

© 2007 г. Я. В. Малютина, А. Е. Кабаков*

Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск

Исследовано, как транскрипционный стресс-ответ и гиперэкспрессия белков теплового шока (БТШ) влияют на клеточную радиорезистентность. Для этого нормальные мышиные фибробласты сравнивали с фибробластами, лишенными HSF1 -гена - транскрипционный фактор, иниции-

рующий экспрессию БТШ в ответ на стресс). Часть клеток инфицировали специальными векторами для экспрессии постоянно активного (мутантного) HSF1 или отдельных БТШ (БТШ70, БТШ56, БТШ27). Обнаружено, что тепловой стресс (43°С, 30 мин) повышал уровень БТШ в нормальных фибробластах и улучшал их выживаемость после воздействия у-излучения, причем оба эти эффекта подавлялись кверцетином (ингибитор HSF1-опосредованной индукции БТШ). В клетках, лишенных HSF1 -гена, тепловой стресс не вызывал ни индукции БТШ, ни усиления радиорезистентности, однако эти эффекты проявлялись после экспрессии в этих клетках активного ИSF1. Устроенная с помощью векторов гиперэкспрессия БТШ70 или/и БТШ27 равным образом усиливала радиорезистентность обеих культур.

Стресс-ответ, транскрипционный фактор, гипертермия, белки теплового шока, апоптоз, радиочувствительность.

Известно, что при клеточном стрессе активируется транскрипционный фактор HSF1, и происходит HSF1-зависимая транскрипция особых генов, кодирующих "белки теплового шока" (БТШ). В результате, клетки с повышенным содержанием БТШ становятся более устойчивыми к различным стрессам, таким как гипертермия, осмотический шок, изменения рИ, гипоксия и пр. [1-3]. Традиционно считалось, что защитная функция БТШ определяется их способностью катализировать ренатурацию или деградацию лабильных клеточных белков, которые денатурируют и агрегируют при стрессовых воздействиях [1-3]. Поскольку на молекулярном уровне наиболее критической мишенью для ионизирующего излучения является ДНК [4, 5], а не белки, роль БТШ в реакции клетки на облучение активно не изучалась. Так, всего несколько публикаций сообщали о том, что клетки, обогащенные БТШ с молекулярными массами 70-73 кДа (БТШ70) и 25-27 кДа (БТШ27), оказываются более устойчивыми к облучению [6-9]. Напротив, другие исследователи [10, 11] не обнаруживали подобных эффектов, и, следовательно, радиопротекторная функция БТШ оставалась недоказанной.

В то же время важен медицинский аспект данной проблемы, так как в онкологических клиниках радиотерапию часто комбинируют с химиотерапией и

*Адресат для корреспонденции: 249036 Обнинск, Калужская обл., МРНЦ РАМН; тел.: (48439) 7-48-47; факс: (495) 956-14-40; e-mail: aekabakov@hotmail.com.

гипертермией. Гипертермия и некоторые химио-препараты могут стимулировать HSFl-зависимую индукцию БТШ, которые (если обладают радиопротекторным потенциалом) будут влиять на реакцию тканей пациента на облучение. Кроме того, некоторые сопутствующие патофизиологические состояния, такие как ишемия/реперфузия, отек, воспаление, ацидоз и т.п., могут локально возникать в тканях пациента и вызывать там индукцию БТШ [1, 3], тем самым, возможно, модифицируя эффекты радиотерапии. С другой стороны, представляется вероятным, что, искусственно манипулируя экспрессией БТШ in vivo, можно будет целенаправленно повышать или понижать радиочувствительность нормальных и опухолевых клеток. Таким образом, комплексное изучение регуляции HSFl-зависимого стресс-ответа и радиопротекторной функции БТШ является актуальной задачей, решение которой могло бы способствовать прогрессу в области лучевой терапии.

Главной целью данной работы было выяснить, может ли транскрипционный стресс-ответ существенно изменять радиорезистентность клеток млекопитающих. Для этого сравнительные исследования проведены на двух родственных культурах мышиных эмбриональных фибробластов, одна из которых была искусственно лишена HSF1 -гена и поэтому не могла индуцировать БТШ в ответ на стресс [12]. В качестве дополнительного инструмента использовался флавоноид

кверцетин, известный как ингибитор HSFl-зави-симой индукции БТШ [13, 14]. Не связанную со стрессом гиперэкспрессию БТШ вызывали специальными вирусными векторами для экспрессии постоянно активированного (мутантного) HSF1 или отдельных БТШ (БТШ70, БТШ56, БТШ27) [15-17]. Полученные результаты показывают, что предрадиационное накопление БТШ70 и БТШ27 в клетках-мишенях может сделать их более устойчивыми к облучению.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

Культуры клеток

В опытах использовали HSF1 -нокаутную культуру эмбриональных мышиных фибробластов (HSF1 ^-клетки, лишенные HSF1 -гена) и родственную культуру эмбриональных мышиных фибробластов с нормальной экспрессией HSF1 (HSFl +/+-клетки) (обе культуры получены от проф. Бенджамина (США) [12]). Эти культуры выращивали в среде Игла с добавлением 10%-ной бычьей фетальной сыворотки, 2 моль/л L-глюта-мина, 10000 мед/мл пенициллин/стрептомицина и 0.11 г/л пирувата натрия (все от "Gibco BRL"), в инкубаторе с 5%-ным углекислым газом (С02) при 37°C [18].

Индукция БТШ тепловым стрессом

Выращенные в пластиковых флаконах (25 см2) HSF1-/- и HSF1+/+ клетки прогревали в термостатированной водяной бане (43°C, 30 мин) и затем инкубировали при нормальных условиях (5%-ный С02, 37°C) в течение 16-18 ч. В некоторые образцы перед прогревом добавляли 30 моль/л кверцетин (Serva, ФРГ) для подавления HSF1-опосредо-ванной индукции БТШ [14].

Облучение

Пластиковые флаконы с клеточными культурами подвергали прямому воздействию у-излуче-ния в дозах 4 или 6 Гр (60Со) на радиотерапевтической установке "Луч" (Латвия) с мощностью дозы 1.1 Гр/мин. В нашей модели такие дискретные дозы вызывали гибель соответственно 40 или 60% облученных клеток, и потому были удобны для изучения защитных эффектов.

Гиперэкспрессия БТШ с помощью вирусных векторов

Полученные от проф. Лэтчмэна (Великобритания) векторы были сконструированы на основе вируса Герпеса (HSV-1), в геном которого встраивали ген, кодирующий постоянно активированный (мутантный) HSF1 [15], или ген, кодирующий БТШ (БТШ70 или БТШ56, или БТШ27) [16, 17].

Контролем служил аналогичный вектор, экс-прессирующий "зеленый флуоресцирующий белок" (ЗФБ). Для инфицирования клеточных культур к ним добавляли среду роста без сыворотки с разведенным в ней вектором (15 рШ на мл). В некоторых экспериментах клетки инфицировали двумя разными векторами одновременно; в этом случае концентрация каждого вектора была 10 рШ на мл. После 1 ч инкубации при 37°С содержащую вектор среду заменяли обычной средой роста, и инфицированные клетки помещали в С02-инкубатор на 16-18 ч до экспериментов с облучением.

Определение клеточной гибели

Апоптоз в популяциях облученных клеток определяли с помощью TUNEL-метода, после того как клетки фиксировали 4%-ным парафор-мальдегидом и затем отмывали в фосфатно-соле-вым буфере (ФСБ, рН 7.4). Для мечения концов ДНК фиксированные препараты обрабатывали реакционной смесью, содержащей 2 моль/л конъюгированного с флуоресцеином дУТФ и 10 единиц дезоксинуклеотидилтрансферазы, в течение 2 ч при 37°С в темноте. Затем, после промывки ФСБ, препараты анализировали на флуоресцентном микроскопе и определяли процент апоптотических (флуоресцентно меченых) клеточных ядер. Параллельно в образцах нефиксированных клеток определяли процент некроза по окрашиванию погибших клеток иодидом пропи-дия (0, 01 моль/л) [16, 17].

Оценка клоногенности

Выживаемость облученных клеток оценивали по их клоногенной способности. После трип-синизации и подсчета концентрации клеток суспензии фибробластов рассевали серийным разведением в чашки Петри. Через 18-20 сут выросшие колонии фиксировали 70%-ным этанолом и окрашивали 0.5%-ным кристалл-фиолетовым красителем. При подсчете учитывали колонии, содержащие как минимум 50 клеток. Клоногенность рассчитывали по соотношению количества колоний к разведению суспензии клеток при посеве [19].

Электрофорез и иммуноблоттинг

Клетки лизировали в "буфере образца" для электрофореза по Лэмли с добавлением ингибиторов протеаз [17, 19]. После фракционирования в 10%-ном SDS-полиакриламидном геле осуществляли электроперенос разделенных полипептидов на нитроцеллюлозную мембрану ("Ат-е^ат", иК). Для иммунодетекции использовали антитела к HSF1 ("СаШюАет") и к индивидуаль-

% апоптических клеток

HSF1 +/+-клетки (4 Гр)

40 h

30 -

20 -

10

1

-0-2 -Д-3 -1-4 -0-5

% апоптических клеток

HSF1 —--клетки (4 Гр)

40

30

20

10

10 12 14 16

2 4 6 8 10 12 14 16 Время после облучения, ч

Рис. 1. Ослабление апоптоза в результате предрадиационной индукции HSF1 - опосредованного стресс-ответа. Контрольные (1) и прогретые клетки (2), клетки, прогретые в присутствии кверцетина (5) и клетки, инфицированные вектором для экспрессии ЗФБ (3) или активного HSF1 (4), облучали в дозах 4 или 6 Гр, после чего на разных временных точках определяли процент апоптотической гибели. * - Отличие от контроля достоверно, р < 0.05.

ным БТШ ("StressGen"). Эндогенный БТШ70 выявлялся моноклональными антителами N27F3-4, реагирующими как с индуцибильной формой (72 кДа), так и с конститутивной формой (73 кДа) этого БТШ. Накопление БТШ70 в инфицированных вектором клетках определялось с помощью моноклональных антител C92F3A-5, специфичных к индуцибельной форме БТШ70. Монокло-нальные антитела KN382/EC1 были использованы для иммунодетекции HSP56. Экспрессия HSP27 выявлялась кроличьими антителами к этому белку ("StressGen"). После обработки блотов пероксидазными конъюгатами "вторых" антител треки антигенов проявляли на рентгеновской пленке с помощью усиленной хемолюминисцен-ции (ECL kit, "Amersham", UK) [17, 19].

Статистический анализ

Все количественные результаты представлены как усредненные данные (± стандартная ошибка) 4-6 независимых экспериментов. Достоверность различий оценивали с помощью программы ANOVA и дополнительно подтверждали по критерию ¿-Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При нормальных условиях роста монослойные культур

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»