РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2007, том 47, № 3, с. 273-279
МОДИФИКАЦИЯ РАДИАЦИОННЫХ ЭФФЕКТОВ
УДК [577.2+576]:539.1.04:612.59
ПРЕДРАДИАЦИОННАЯ ИНДУКЦИЯ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА ПОВЫШАЕТ КЛЕТОЧНУЮ РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ
© 2007 г. Я. В. Малютина, А. Е. Кабаков*
Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск
Исследовано, как транскрипционный стресс-ответ и гиперэкспрессия белков теплового шока (БТШ) влияют на клеточную радиорезистентность. Для этого нормальные мышиные фибробласты сравнивали с фибробластами, лишенными HSF1 -гена - транскрипционный фактор, иниции-
рующий экспрессию БТШ в ответ на стресс). Часть клеток инфицировали специальными векторами для экспрессии постоянно активного (мутантного) HSF1 или отдельных БТШ (БТШ70, БТШ56, БТШ27). Обнаружено, что тепловой стресс (43°С, 30 мин) повышал уровень БТШ в нормальных фибробластах и улучшал их выживаемость после воздействия у-излучения, причем оба эти эффекта подавлялись кверцетином (ингибитор HSF1-опосредованной индукции БТШ). В клетках, лишенных HSF1 -гена, тепловой стресс не вызывал ни индукции БТШ, ни усиления радиорезистентности, однако эти эффекты проявлялись после экспрессии в этих клетках активного ИSF1. Устроенная с помощью векторов гиперэкспрессия БТШ70 или/и БТШ27 равным образом усиливала радиорезистентность обеих культур.
Стресс-ответ, транскрипционный фактор, гипертермия, белки теплового шока, апоптоз, радиочувствительность.
Известно, что при клеточном стрессе активируется транскрипционный фактор HSF1, и происходит HSF1-зависимая транскрипция особых генов, кодирующих "белки теплового шока" (БТШ). В результате, клетки с повышенным содержанием БТШ становятся более устойчивыми к различным стрессам, таким как гипертермия, осмотический шок, изменения рИ, гипоксия и пр. [1-3]. Традиционно считалось, что защитная функция БТШ определяется их способностью катализировать ренатурацию или деградацию лабильных клеточных белков, которые денатурируют и агрегируют при стрессовых воздействиях [1-3]. Поскольку на молекулярном уровне наиболее критической мишенью для ионизирующего излучения является ДНК [4, 5], а не белки, роль БТШ в реакции клетки на облучение активно не изучалась. Так, всего несколько публикаций сообщали о том, что клетки, обогащенные БТШ с молекулярными массами 70-73 кДа (БТШ70) и 25-27 кДа (БТШ27), оказываются более устойчивыми к облучению [6-9]. Напротив, другие исследователи [10, 11] не обнаруживали подобных эффектов, и, следовательно, радиопротекторная функция БТШ оставалась недоказанной.
В то же время важен медицинский аспект данной проблемы, так как в онкологических клиниках радиотерапию часто комбинируют с химиотерапией и
*Адресат для корреспонденции: 249036 Обнинск, Калужская обл., МРНЦ РАМН; тел.: (48439) 7-48-47; факс: (495) 956-14-40; e-mail: aekabakov@hotmail.com.
гипертермией. Гипертермия и некоторые химио-препараты могут стимулировать HSFl-зависимую индукцию БТШ, которые (если обладают радиопротекторным потенциалом) будут влиять на реакцию тканей пациента на облучение. Кроме того, некоторые сопутствующие патофизиологические состояния, такие как ишемия/реперфузия, отек, воспаление, ацидоз и т.п., могут локально возникать в тканях пациента и вызывать там индукцию БТШ [1, 3], тем самым, возможно, модифицируя эффекты радиотерапии. С другой стороны, представляется вероятным, что, искусственно манипулируя экспрессией БТШ in vivo, можно будет целенаправленно повышать или понижать радиочувствительность нормальных и опухолевых клеток. Таким образом, комплексное изучение регуляции HSFl-зависимого стресс-ответа и радиопротекторной функции БТШ является актуальной задачей, решение которой могло бы способствовать прогрессу в области лучевой терапии.
Главной целью данной работы было выяснить, может ли транскрипционный стресс-ответ существенно изменять радиорезистентность клеток млекопитающих. Для этого сравнительные исследования проведены на двух родственных культурах мышиных эмбриональных фибробластов, одна из которых была искусственно лишена HSF1 -гена и поэтому не могла индуцировать БТШ в ответ на стресс [12]. В качестве дополнительного инструмента использовался флавоноид
кверцетин, известный как ингибитор HSFl-зави-симой индукции БТШ [13, 14]. Не связанную со стрессом гиперэкспрессию БТШ вызывали специальными вирусными векторами для экспрессии постоянно активированного (мутантного) HSF1 или отдельных БТШ (БТШ70, БТШ56, БТШ27) [15-17]. Полученные результаты показывают, что предрадиационное накопление БТШ70 и БТШ27 в клетках-мишенях может сделать их более устойчивыми к облучению.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Культуры клеток
В опытах использовали HSF1 -нокаутную культуру эмбриональных мышиных фибробластов (HSF1 ^-клетки, лишенные HSF1 -гена) и родственную культуру эмбриональных мышиных фибробластов с нормальной экспрессией HSF1 (HSFl +/+-клетки) (обе культуры получены от проф. Бенджамина (США) [12]). Эти культуры выращивали в среде Игла с добавлением 10%-ной бычьей фетальной сыворотки, 2 моль/л L-глюта-мина, 10000 мед/мл пенициллин/стрептомицина и 0.11 г/л пирувата натрия (все от "Gibco BRL"), в инкубаторе с 5%-ным углекислым газом (С02) при 37°C [18].
Индукция БТШ тепловым стрессом
Выращенные в пластиковых флаконах (25 см2) HSF1-/- и HSF1+/+ клетки прогревали в термостатированной водяной бане (43°C, 30 мин) и затем инкубировали при нормальных условиях (5%-ный С02, 37°C) в течение 16-18 ч. В некоторые образцы перед прогревом добавляли 30 моль/л кверцетин (Serva, ФРГ) для подавления HSF1-опосредо-ванной индукции БТШ [14].
Облучение
Пластиковые флаконы с клеточными культурами подвергали прямому воздействию у-излуче-ния в дозах 4 или 6 Гр (60Со) на радиотерапевтической установке "Луч" (Латвия) с мощностью дозы 1.1 Гр/мин. В нашей модели такие дискретные дозы вызывали гибель соответственно 40 или 60% облученных клеток, и потому были удобны для изучения защитных эффектов.
Гиперэкспрессия БТШ с помощью вирусных векторов
Полученные от проф. Лэтчмэна (Великобритания) векторы были сконструированы на основе вируса Герпеса (HSV-1), в геном которого встраивали ген, кодирующий постоянно активированный (мутантный) HSF1 [15], или ген, кодирующий БТШ (БТШ70 или БТШ56, или БТШ27) [16, 17].
Контролем служил аналогичный вектор, экс-прессирующий "зеленый флуоресцирующий белок" (ЗФБ). Для инфицирования клеточных культур к ним добавляли среду роста без сыворотки с разведенным в ней вектором (15 рШ на мл). В некоторых экспериментах клетки инфицировали двумя разными векторами одновременно; в этом случае концентрация каждого вектора была 10 рШ на мл. После 1 ч инкубации при 37°С содержащую вектор среду заменяли обычной средой роста, и инфицированные клетки помещали в С02-инкубатор на 16-18 ч до экспериментов с облучением.
Определение клеточной гибели
Апоптоз в популяциях облученных клеток определяли с помощью TUNEL-метода, после того как клетки фиксировали 4%-ным парафор-мальдегидом и затем отмывали в фосфатно-соле-вым буфере (ФСБ, рН 7.4). Для мечения концов ДНК фиксированные препараты обрабатывали реакционной смесью, содержащей 2 моль/л конъюгированного с флуоресцеином дУТФ и 10 единиц дезоксинуклеотидилтрансферазы, в течение 2 ч при 37°С в темноте. Затем, после промывки ФСБ, препараты анализировали на флуоресцентном микроскопе и определяли процент апоптотических (флуоресцентно меченых) клеточных ядер. Параллельно в образцах нефиксированных клеток определяли процент некроза по окрашиванию погибших клеток иодидом пропи-дия (0, 01 моль/л) [16, 17].
Оценка клоногенности
Выживаемость облученных клеток оценивали по их клоногенной способности. После трип-синизации и подсчета концентрации клеток суспензии фибробластов рассевали серийным разведением в чашки Петри. Через 18-20 сут выросшие колонии фиксировали 70%-ным этанолом и окрашивали 0.5%-ным кристалл-фиолетовым красителем. При подсчете учитывали колонии, содержащие как минимум 50 клеток. Клоногенность рассчитывали по соотношению количества колоний к разведению суспензии клеток при посеве [19].
Электрофорез и иммуноблоттинг
Клетки лизировали в "буфере образца" для электрофореза по Лэмли с добавлением ингибиторов протеаз [17, 19]. После фракционирования в 10%-ном SDS-полиакриламидном геле осуществляли электроперенос разделенных полипептидов на нитроцеллюлозную мембрану ("Ат-е^ат", иК). Для иммунодетекции использовали антитела к HSF1 ("СаШюАет") и к индивидуаль-
% апоптических клеток
HSF1 +/+-клетки (4 Гр)
40 h
30 -
20 -
10
1
-0-2 -Д-3 -1-4 -0-5
% апоптических клеток
HSF1 —--клетки (4 Гр)
40
30
20
10
10 12 14 16
2 4 6 8 10 12 14 16 Время после облучения, ч
Рис. 1. Ослабление апоптоза в результате предрадиационной индукции HSF1 - опосредованного стресс-ответа. Контрольные (1) и прогретые клетки (2), клетки, прогретые в присутствии кверцетина (5) и клетки, инфицированные вектором для экспрессии ЗФБ (3) или активного HSF1 (4), облучали в дозах 4 или 6 Гр, после чего на разных временных точках определяли процент апоптотической гибели. * - Отличие от контроля достоверно, р < 0.05.
ным БТШ ("StressGen"). Эндогенный БТШ70 выявлялся моноклональными антителами N27F3-4, реагирующими как с индуцибильной формой (72 кДа), так и с конститутивной формой (73 кДа) этого БТШ. Накопление БТШ70 в инфицированных вектором клетках определялось с помощью моноклональных антител C92F3A-5, специфичных к индуцибельной форме БТШ70. Монокло-нальные антитела KN382/EC1 были использованы для иммунодетекции HSP56. Экспрессия HSP27 выявлялась кроличьими антителами к этому белку ("StressGen"). После обработки блотов пероксидазными конъюгатами "вторых" антител треки антигенов проявляли на рентгеновской пленке с помощью усиленной хемолюминисцен-ции (ECL kit, "Amersham", UK) [17, 19].
Статистический анализ
Все количественные результаты представлены как усредненные данные (± стандартная ошибка) 4-6 независимых экспериментов. Достоверность различий оценивали с помощью программы ANOVA и дополнительно подтверждали по критерию ¿-Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При нормальных условиях роста монослойные культур
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.