КРИСТАЛЛОГРАФИЯ, 2014, том 59, № 1, с. 80-82
СТРУКТУРА МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
УДК 577.23
ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КРИСТАЛЛОВ ФОТОСИСТЕМЫ II ИЗ Thermosynechococcus elongates
© 2014 г. А. Г. Габдулхаков, М. В. Донцова
Институт белка РАН, Пущино
E-mail: azat@vega.protres.ru Поступила в редакцию 13.06.2013 г.
Фотосистема II (ФС11) представляет собой многокомпонентный фермент, осуществляющий расщепление воды до молекулярного кислорода, протонов и электронов под действием света. Фотосистема II содержится в мембране тилакоидов цианобактерий, зеленых водорослей и растений. Кристаллизация этого комплекса из тилакоидных мембран сопряжена с большими трудностями. На качество кристаллов и дифракционных данных влияет высокая чувствительность ФСП к свету и радиационному излучению. Поэтому кристаллическая структура ФСП из Thermosynechococcus elongates до сих пор не определена с высоким разрешением. Оптимизация метода сбора дифракционных данных, полученных от кристаллов ФСП, позволила повысить разрешение до 2.75 А. Благодаря этому стало возможным определение положений ионов и некоторых молекул воды, играющих важную роль в работе ФСП.
DOI: 10.7868/S0023476114010044
ВВЕДЕНИЕ
Кислород, представляющий собой побочный продукт процесса фотосинтеза, является основой жизнедеятельности человека. От количества кислорода в воздухе в значительной степени зависит общее состояние людей. Кроме того, из свободного кислорода формируется озоновый слой атмосферы, защищающий от УФ-излучения все живое на Земле. Несколько миллиардов лет потребовалось фотосинтезирующим организмам, чтобы сформировались запасы этого газа в атмосфере.
В природе образование кислорода из воды под воздействием света осуществляет фермент, называемый фотосистема II (ФСП). Исследования пространственной структуры ФС11 ведутся не один десяток лет. Установлено, что ФС11 состоит из комплекса белков и липидов, с которым связаны хлоро-филлы и другие пигменты. Каталитическим центром ФС11 является уникальный Мп4Са05-кластер, осуществляющий фотоокисление воды. Несмотря на то, что пространственное расположение белков, липидов и пигментов внутри ФС11 изучено достаточно подробно, этот фермент по-прежнему вызывает особый интерес. До сих пор остается непонятным механизм фотосинтетической реакции, а также процесс поступления субстратов и вывода продуктов реакции, имеющих место внутри этого многомерного белок-пигментного комплекса. Поэтому изучение пространственной структуры ФС11 с атомарным разрешением и анализ взаимодействия ФС11 с малыми молекулами и ионами является актуальным.
В данной работе кратко описана процедура выделения, очистки и кристаллизации ФСП из цианобактерии Thermosynechococcus elongates (T. elongates). Разработана стратегия сбора дифракционных данных с таких кристаллов, в результате которой удалось снять набор данных кристаллов ФСП с разрешением 2.75 А. В настоящее время пространственная структура ФСП уточняется.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Выделение, очистка и кристаллизация препарата фотосистемы II из цианобактерии T. elongates. Фотосистема II выделена из тилакоидной мембраны цианобактерий T. elongatus и очищена с помощью ионообменной хроматографии. Процедура очистки описана в [1]. Для кристаллизации методом "порций" раствор с ФСП смешивался с равным объемом осадителя, в состав которого входили 15%-ный полиэтиленгликоль 2000, 5 мМ CaCl2 и 100 мМ пиперазин-1,4-бис(2-этансуль-фоновой) кислоты, титрованный NaOH (pH 7.0). После осторожного и тщательного перемешивания полученный раствор расфасовывали по 5 мкл в стеклянные капилляры. Размер одного капилляра составлял 75 мм в длину и 1.15 мм во внутреннем диаметре. Раствор ФСП хранился в отсутствие света в течение нескольких дней при температуре 19°C. В результате через 2—5 дней образовывались кристаллы. Процедура кристаллизации ФС II из T. elongatus рассмотрена в [1].
Сбор дифракционных данных кристаллов фотосистемы II. Полученные кристаллы ФСП отража-
ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
81
ли рентгеновские лучи с разрешением 2.75 А. Дифракционные данные кристалла ФС11 собраны на линии ID 14-2 ESRF (Гренобль, Франция). Набор данных получен при длине волны 0.9756 А и температуре 100 К. Технические параметры эксперимента по сбору дифрагированного кристаллом ФС11 набора интенсивностей и значения статистических параметров фурье-спектров приведены в таблице. Первичная обработка экспериментального набора интенсивностей и выбор стратегии обработки проведены в рамках программы iMosflm [2]. Получение результирующего набора интенсивностей осуществлено в комплексе программ XDS [3]. Кристаллографические характеристики набора и параметры съемки приведены в таблице.
Определение структуры фотосистемы II. Кристаллическая структура ФС11 решена методом молекулярного замещения по программе PHASER [4] программного комплекса CCP4 [5]. В качестве стартовой модели для решения и уточнения структуры фермента использовалась пространственная структура одного из мономеров ФС11 из T. elongates, полученная c разрешением 2.9 А (PDB ID 3BZ1) [6]. Структура ФС11 уточнялась в программном комплексе PHENIX [7]. Для контроля процедуры уточнения и расчета свободного R-фактора (Rfree) использовался контрольный набор рефлексов, отобранных произвольно из экспериментальных данных. После определения положения и ориентации двух мономеров в кристаллической ячейке выполнялась процедура "rigid-body" для всех двадцати белковых субъединиц в каждом мономере ФС11. После этого применялась процедура "annealing" с фиксацией всех атомов основных цепей полипептидов. Ручная правка модели проводилась с использованием программы СООТ [8] по картам электронной плотности разностных синтезов Фурье (2Fо-Fс) и ^о-F^, где Fо — экспериментальные, Fс — расчетные модули структурных факторов.
Корректность получаемых по ходу уточнения результатов контролировали с помощью программ Procheck [9], WhatCheck [10] и COOT [8].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Оптимизация условий сбора дифракционных данных кристаллов фотосистемы II. При сборе данных кристаллов ФС11 существуют две основные проблемы: быстрое разрушение кристалла под воздействием света и интенсивных рентгеновских лучей синхротронного излучения, анизотропия кристалла, т.е. предел разрешения меняется в зависимости от ориентации кристалла в рентгеновском пучке, что существенно ограничивает полезную разрешающую способность кристаллов. Поэтому съемка данных с кристаллов ФС11 проводилась в отсутствие света, а при отборе под микроскопом кристаллов использовался
Кристаллографические данные и параметры съемки кристаллов фотосистемы II из T. elongates
Пространственная группа P212121 (№ 19)
а, Ь, с, А 127.6, 225.4, 306.1
а, в, у, град 90
Молекулярная масса мономера 385
комплекса ФС11, кДа
Число мономеров ФС11 в неза- 2
висимой части
Длина волны, А 0.9756
Разрешение, А 50.0-2.75 (2.8-2.75)*
Число измеренных рефлексов 564637
Расстояние кристалл-детек- 295
тор, мм
Область качания, град 0.3-0.5
Область вращения, град 70.0
Число независимых рефлексов 214137
Повторяемость 2.63 (1.86)*
Полнота набора, % 93.6 (70.4)*
Мозаичность, град 0.25
Среднее значение ^ст^ 6.57 (1.55)*
Rmerge 9.2 (58.4)*
Коэффициент Мэтьюза (Vи), 3.12
А3/Да-1
Содержание растворителя, % 60.3
* Данные для области высокого разрешения.
зеленый светофильтр как наименее разрушительный. Для исследований кристаллов ФС11 была выбрана линия синхротронного излучения ГО14-2, обладающая точным механизмом вращения кристалла и узким пучком излучения диаметром 40— 50 мкм. Для сбора данных использовалась методика перемещения точки облучения вдоль оси вращения кристалла [11], что позволяет уменьшить дозу радиации и, как следствие, разрушение самого кристалла. Кроме того, необходимо было выбрать оптимальные углы осцилляции при различной ориентации кристалла. Достаточно узкие, чтобы не происходило перекрывания дифракционных пятен, учитывая, что размер наибольшей стороны кристаллической ячейки составляет более 300 А, и при этом достаточно широкие, чтобы получить полный набор до разрушения кристалла. В результате удалось собрать три фрагментарных набора по 20 рентгенограмм с углом осцилляции 0.5° и четыре набора по 34 рентгенограммы с углом осцилляции 0.3°. Полученные данные собраны с неперекрывающихся участков одного кристалла и обработаны программным комплексом XDS. На рис. 1 приведена фотография кристалла по окончании съемки со следами его разрушения под воздействием синхротронного излу-
82
ГАБДУЛХАКОВ, ДОНЦОВА
Рис. 2. Фрагмент карты электронной плотности фотосистемы II из T. elongates с разрешением 2.75 А в области связывания второго иона хлора при уровне срезки 1.3ст. Водородные связи показаны пунктиром, длина связей в ангстремах.
Рис. 1. Кристалл фотосистемы после сбора дифракционных данных на линии синхротронного излучения ID14-2. Пунктиром выделены области разрушения кристалла под воздействием синхротронного излучения.
чения. Несмотря на разрушение кристалла, в процессе съемки удалось получить непрерывный набор данных с достаточно высоким уровнем полноты и разрешением 2.75 А (таблица).
Пространственная структура фотосистемы II. Кристаллы ФСК обладают той же пр. гр. (Р212121) и сходными параметрами ячейки (a = 127.6, b = = 225.4, c = 306.1 А, а = р = у = 90.0°), что и предыдущие кристаллы ФСК из T. elongates. Структура фотокомплекса решена методом молекулярного замещения, в качестве стартовой модели использовалась структура мономера ФСП из T. elongates, полученная c разрешением 2.9 А (PDB ID 3BZ1) [6]. Уточненная структура ФСП содержит два мономера фотокомплекса, связанных некристаллографической осью второго порядка. При этом каждый из мономеров ФСП состоит из 20 белковых субъединиц (17 из них находятся в мембранной части фотосистемы и три в люменальной), 35 молекул хлорофилла а, двух молекул феофитина, 12 Р-каротиноидов, двух молекул гема, двух молекул пластохинонов QA и QB, 25 молекул различных липидов, Мп4Са05-класте-ра и других ионов. По сравнению с полученной ранее структурой ФСП с разрешением 2.9 А отсут
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.