ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 2007, том 49, № 12, с. 2092-2106
УДК 541(49+64):535.37
ПРЕИМУЩЕСТВА И ПЕРСПЕКТИВЫ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО МЕТОДА ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ДНК, ОСНОВАННОГО НА КОНКУРЕНТНОМ ВЫТЕСНЕНИИ ИНТЕРКАЛИРОВАННОГО КРАСИТЕЛЯ1
© 2007 г. М. В. Жирякова, В. А. Изумрудов
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова.
Химический факультет 119992 Москва, Ленинские горы
Взаимодействие катионных (био)полимеров с ДНК может вызывать перенос интеркалированного катионного красителя бромистого этидия из двойной спирали в раствор, что сопровождается тушением флуоресценции зонда. Эффективное вытеснение этидия из нуклеиновой кислоты, обнаруженное при изучении кооперативного электростатического связывания ДНК с солями полимерных оснований, положено в основу разработки флуоресцентного метода изучения полиэлектролитных комплексов ДНК. На примере широкого круга модельных поликатионов продемонстрирована плодотворность этого подхода для оценки кооперативности взаимодействия, получения рН-зависимых профилей реакций образования комплексов и конкурентного связывания, создания систем с заданной и контролируемой стабильностью в водно-солевых средах, что может быть особенно важным для конструирования эффективных полиэлектролитных средств доставки генетического материала в клетку.
ВВЕДЕНИЕ
Катионный краситель бромистый этидий (БЭ) широко используется в качестве флуоресцентного зонда для идентификации нативной ДНК и для прокрашивания нуклеиновых кислот при проведении гель-электрофореза. Это обусловлено способностью БЭ самопроизвольно встраиваться (интеркалировать) в двойную спираль, что сопровождается резким увеличением интенсивности флуоресценции I этидия [1]. Возгорание флуоресценции обусловлено тем, что при фотовозбуждении свободного (не связанного с ДНК) зонда в растворе происходит тушение его флуоресценции по безызлучательному пути, включающему в себя взаимодействие протона аминогруппы с растворителем, а будучи интеркалированным между парами оснований двойной спирали ДНК, катион этидия экранируется от контакта с растворителем, что практически полностью предотвращает тушение флуоресценции по механизму переноса
1 Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 07-03-00228а).
E-mail: izumrud@genebee.msu.su (Изумрудов Владимир Алексеевич).
протона [2] или растворенным кислородом. Это приводит к увеличению времени жизни в возбужденном состоянии от 1.8 нс (в воде) до 23 нс [3] и уменьшению константы тушения в 30 раз [4]. Комплексы ДНК • БЭ характеризуются весьма высокой устойчивостью (Кс ~ 106 моль/л [1]), обусловленной специфическими взаимодействиями плоских этидиевых катионов с основаниями ДНК, и не разрушаются даже в концентрированных растворах низкомолекулярных солей [1, 5]. БЭ встраивается в двойную спираль без нарушения уотсон-криковской схемы спаривания оснований. Однако, чтобы интеркаляция произошла, пары оснований должны раздвинуться, что отражается в последовательном увеличении шага спирали и уменьшении гибкости цепи по мере добавления красителя [6]. Встраивание молекул БЭ подчиняется принципу исключения ближайших соседей: каждое второе место (ближайший сосед вдоль оси двойной спирали ДНК) остается свободным из-за нарушения геометрии нуклеотидов, примыкающих к интеркаляторам [7]. Другими словами, стопкообразное расположение пар оснований с характерным расстоянием 3.4 А сохраняется, но место каждой третьей пары становится занятым молекулой интеркалятора. Таким обра-
2092
зом, стехиометрия насыщения составляет одну молекулу БЭ на четыре молекулы нуклеотида (на две пары оснований) и практически не зависит от содержания пар гуанин-цитозин, последовательности нуклеотидов в ДНК, молекулярной массы ДНК или ионной силы раствора [1]. Значение интенсивности флуоресценции также достигает максимума при этом соотношении. При дальнейшем добавлении красителя величина I перестает расти и даже несколько снижается, что объясняют либо конформационными изменениями спирали при взаимодействии с молекулами БЭ, находящимися в избытке, либо энергетическими переходами между молекулами красителя [5]. Интенсивность флуоресценции комплекса ДНК • БЭ практически не меняется в широком интервале изменения кислотности среды (4.0 < рН < 11.0), а достижение граничных значений рН, соответствующих началу кислотной и щелочной денатурации ДНК (т.е. расплетанию двойной спирали), приводит к тушению [1]. Именно на этом свойстве красителя основано использование БЭ как индикатора на наличие двуспиральности в структуре нуклеиновых кислот и для оценки доли дву-тяжевых участков в них.
Первые попытки использования флуоресцентных свойств БЭ для изучения взаимодействия ДНК с положительно заряженными партнерами были предприняты почти 30 лет назад в работах по связыванию природных олигомерных аминов, главным образом спермина и спермидина [8, 9]. Их добавление к раствору комплекса ДНК • БЭ приводило к тушению флуоресценции, что позволило авторам оценить константы связывания по концентрации тушителя, при которой значение I падало в 2 раза. Для спермидина с тремя аминогруппами в молекуле эта величина составила 3 х 105 моль/л, тогда как для спермина, имеющего на одну аминогруппу больше, она оказалась на порядок более высокой, 5 х 106 моль/л [8]; это хорошо согласуется с длиной кооперативного участка связывания, который для сильно заряженных полиэлектролитов составляет 4-6 звеньев. В работах [8, 9] не рассматривался вопрос о том, чем обусловлено наблюдаемое тушение -вытеснением молекул БЭ или изменением их локального окружения в процессе связывания. Между тем, такая информация важна и необходима для корректного анализа результатов флуоресцентных измерений.
Новый импульс в развитие данного подхода добавил все возрастающий интерес ученых, работающих на стыке полимерной химии, молекулярной биологии и медицины, к созданию средств доставки генетического материала в ядра клеток. Способность катионных полимеров или положительно заряженных липидов, образующих с ДНК соответственно полиэлектролитные комплексы (полиплексы) или липидные комплексы (липо-плексы), делает актуальной разработку наиболее эффективных и нетоксичных носителей на их основе. Для оптимизации синтеза полимерных носителей необходимо выявить влияние структуры и молекулярных характеристик поликатионов на физико-химические свойства полиплексов и установить их взаимосвязь с эффективностью доставки целевой ДНК в клетку. Успешное решение этой задачи во многом определяется наличием простого, доступного, чувствительного и высокоинформативного метода, позволяющего проводить сравнительную экспресс-оценку связывания различных катионных (био)полимеров с ДНК в буферных растворах, при физиологических условиях, а также при изменении рН, ионной силы и температуры. В работе, опубликованной 12 лет назад [10], экспериментально доказана способность солей различных полимерных оснований эффективно вытеснять интеркалированные молекулы БЭ в результате кооперативного электростатического связывания с ДНК. Там же изложены основы метода наблюдения за образованием полиплексов и их устойчивостью в водно-солевых средах вплоть до полной диссоциации. Вслед за этой публикацией появилось множество статей по использованию флуоресценции БЭ для изучения связывания ДНК с различными катион-ными полимерами и олигомерами, например основными полипептидами [11-13], линейными и разветвленными полиаминами [14-17], катион-ными дендримерами [17, 18]. Некоторые из перечисленных публикаций, а также другие работы по этой теме нашли свое отражение в обзоре [19]. В настоящее время тушение флуоресценции БЭ стало рутинным приемом, который широко используется в качестве доказательства связывания положительно заряженных партнеров с ДНК, причем круг объектов таких исследований непрерывно расширяется, включая в себя, например, полибетаины [20] или катионные амфифильные соединения [21-23], заслуживающие отдельного рассмотрения.
В настоящей работе мы ставили перед собой задачу продемонстрировать преимущества и потенциальные возможности метода, которые выходят далеко за рамки его обычного применения как способа качественной оценки сродства различных партнеров к ДНК. С этой целью мы систематизировали основные результаты, полученные и опубликованные нами на протяжении последних лет, и дополнили их новыми данными. Плодотворность и перспективность подхода уже находит свое подтверждение в модельных исследованиях, призванных оптимизировать синтез эффективных средств доставки генетического материала невирусной природы. Так, с помощью разрабатываемых экспериментальных приемов были получены и проанализированы рН-зависи-мые профили реакций ДНК с поликатионами, что позволило выявить значимость протонирова-ния аминогрупп поликатиона, включенного в состав комплекса, как фактора, существенно повышающего эффективность доставки генетического материала в клетки [24].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы
Препараты NaCl, HCl и NaOH имели квалификацию х.ч. Буферные растворы с ионной силой G.G2 моль/л и различными значениями pH готовили из образцов биологических буферов MES, HEPES, CAPS, CHES, TRIS фирмы "Sigma" (США). Во всех экспериментах растворителем служила бидистиллированная вода.
Препарат БЭ получен от фирмы "Sigma" (США). Концентрацию растворов БЭ определяли спектрофотометрически с помощью мольного коэффициента экстинкции е480 = 5б00 л/(моль см) [25].
Использовали препарат натриевой соли ДНК из тимуса теленка (~10000 пар оснований) фирмы "Sigma" (США) без дополнительной очистки. Концентрацию фосфатных групп ДНК [P] в растворе определяли спектрофотометрически, исходя из мольного коэффициента экстинкции £2б0 = б500 л/(моль см) [2б].
Поли-^этил-4-винилпиридиний бромид (ПЭП) со среднечисленной степенью полимеризации Pn = 1G, 2G, 4G и средневесовой степенью полимеризации Pw = 1GG, 13GG получали исчерпывающим
алкилированием 10%-ных метанольных растворов поли-4-винилпиридина соответствующих степеней полимеризации ("Aldrich", США) пятикратным избытком бромистого этила при нагревании до 60°
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.