ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 4, с. 634-638
= МЕТОДИКА
УДК 581.1
ПРЕПАРАТИВНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ ДНК МХОВ ВЫСОКОГО КАЧЕСТВА
© 2007 г. Ф. Митман, С. Динстбах, Г. Вагнер
Институт физиологии растений, Гиссенский университет Юстуса Либиха, Гиссен, Германия
Поступила в редакцию 12.01.2007 г.
В течение нескольких лет Physcomitrella patens Hedw. было единственным наземным растением, у которого гомологичная рекомбинация могла приводить к целенаправленному выключению работы гена, что представляет собой эффективный и элегантный подход к изучению функционирования гена. Недавно было показано, что этот подход может быть применен и в случае мха Ceratodon pur-pureus Hedw. Однако для успешного применения этого подхода в случае обоих видов мхов необходимо эффективно выделять из них ДНК высокого качества. В данной работе мы предлагаем усовершенствованный протокол выделения ДНК из тканей мхов: этот протокол быстрый, дешевый, простой и надежный. В результате можно выделить ДНК в количестве, достаточном для полиме-разной цепной реакции и Саузерн-блот-анализа. Предлагаемая модификация метода была также успешно опробована на водоросли Mougeotia scalaris Hass. и высшем растении Arabidopsis thaliana L.
Ceratodon purpureus - Physcomitrella patens - экстракция ДНК - целенаправленное выключение гена -Саузерн-блот-анализ
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы целенаправленное выключение генов путем гомологичной рекомбинации стало эффективным и элегантным приемом для анализа функций генов животных, дрожжей, бактерий и некоторых одноклеточных водорослей. В то же время, этот подход не применялся для наземных растений за исключением мха Physcomitrella patens. Однако недавно было обнаружено, что гомологичные рекомбинации происходят достаточно часто и у мха Ceratodon purpureus, что позволяет использовать их для целенаправленного выключения генов [1].
Для выбора стабильных линий трансформантов для гомологичной рекомбинации и надежного доказательства ожидаемой модификации определенного локуса с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и Саузерн-блот-анализа необходимы большие количества высокомолекулярной ДНК [2]. Обычно ДНК мхов экстрагируют так, как описано Rogers и Bendich [3] или Doyle
Сокращения: ДИГ - дигоксигенин; дНТФ - дезоксирибонук-леотидтрифосфаты; ДТТ - дитиотрейтол; ИАС - изоамило-вый спирт; КТ - комнатная температура; МЕ - 2-меркаптоэта-нол; ТБЭ - Трис-борная кислота-ЭДТА; ТЭ - Трис-ЭДТА; ПЦР - полимеразная цепная реакция; ПВП - поливинилпир-ролидон; ЦТАБ - цетилтриметиламмоний бромид. Адрес для корреспонденции: F. Mittmann. Institut für Pflanzenphysiologie, Justus Liebig Universität Giessen, Senckenberg-strasse 3, D-35390 Giessen, German. Fax: +49 641 99 35429; e-mail: mittmann@unimol.de
и Doyle [4]. Оба метода основаны на применении катионного детергента цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ). Для осаждения нуклеиновых кислот Rogers и Bendich снижали концентрацию одновалентных катионов, а Doyle и Doyle использовали для этой цели изопропанол, получая при этом большие количества менее чистой ДНК. Однако ни один из пока опубликованных протоколов и ни один из коммерчески доступных наборов реактивов (см. [5] для обсуждения) не отвечают всем или большинству перечисленных ниже требований: получение (1) высокого выхода (2) высокомолекулярной (3) стабильной ДНК (4) при малой затрате времени и (5) использовании недорогого оборудования и реактивов. Кроме того, (6) ДНК должна быть легко доступна для модифицирующих ферментов.
В данной работе мы описываем быстрый, легко воспроизводимый и дешевый метод, основанный на применении ЦТАБ и обычного лабораторного оборудования. Мы получили более высокий выход ДНК, чем при использовании методов Rogers и Bendich [3] и Doyle и Doyle [4] и сравнимый с таковым, указанным Schlink и Reski [5], но полученный с гораздо меньшими затратами.
МЕТОДИКА
Растительный материал. Мхи Ceratodon purpureus Hedw. и Physcomitrella patens Hedw. выращивали при 20°С в жидкой среде BCE225 (1 мМ MgSO4, 1.8 мМ KH2PO4, 10 мМ KNO3, 14 мкМ
Fe(III)C6H5O7, 2 мМ CaCl2, 5 мМ C4H12N2O6, 9.93 мкМ H3BO3, 1.97 мкМ MnCl2, 0.12 мкМ Al2K2(SO4)4, 0.23 мкМ CoCl2, 0.22 мкМ CuSO4, 0.19 мкМ ZnSO4, 0.24 мкМ KBr, 0.17 мкМ KI, 0.66 мкМ LiCl, 0.15 мкМ SnCl2, 0.10 мкМ Na2MoO4 и 0.2%-ную (вес/объем) глюкозу) при интенсивности освещения 30-50 мкмоль/(м2 с) ФАР в течение 16 ч в день. Культуру Physcomitrella patens продували воздухом, пропущенным через стерильный фильтр. Arabidopsis thaliana L. и Mougeo-tia scalaris Hass. культивировали, соответственно, согласно [6] и [7].
Полимеразная цепная реакция. ПЦР проводили с 0.5 ед. HotFire Taq полимеразы ("Solis Biodyne", Эстония) в 20 мкл реакционной среды, содержавшей 2.5 мМ MgCl2, 0.5 мкМ олигонуклеотидные праймеры, 0.2 мМ дНТР (дезоксирибонуклеотид-трифосфаты) и 10 нг суммарной ДНК в качестве матрицы. Отжиг проводили по правилу Wallace [8]. Проводили 30 циклов амплификации.
Саузерн-блот-анализ. Суммарную ДНК (150 нг/мкл) рестриктировали в рекомендованном буфере в течение 3-5 ч, используя 3 ед. ре-стриктаз на 1 мкг ДНК. ДНК осаждали этанолом с добавлением ацетата натрия, как описано в [9]. Осадок промывали 75%-ным этанолом и растворяли в стандартном буфере для образца (10 мкл на 3 мкг ДНК). На каждую дорожку геля наносили 3 или 4 мкг ДНК. После электрофореза в 0.7%-ном (вес/объем) агарозном геле в 1 х ТБЭ-буфере (89 мМ Трис, 89 мМ борная кислота и 2 мМ ЭДТА), ДНК инкубировали в бромистом этидии (0.5 мкг/мл в 1 х ТБЭ-буфере) и фотографировали в УФ с использованием трансиллюминатора. Для Саузерн-блот-анализа ДНК денатурировали (0.5 М NaOH и 1.5 М NaCl, дважды по 20 мин), нейтрализовали в 20 х SSC (3 М NaCl, 0.3 М лимоннокислый натрий, pH 7.0) в течение 20 мин и переносили на положительно заряженную нейлоновую мембрану ("Roche", Германия), используя 20 х SSC в качестве буфера для переноса и капилляр для нанесения образца. Мембрану облучали УФ (260 нм) на трансиллюминаторе в течение 1 мин для фиксации образца. Гибридизацию и детекцию проводили, используя нерадиоактивный дигоксигенин (ДИГ) для мечения и систему детекции ("Roche") с использованием NBT/X фосфата (Nitro Blue Tet-razolium/5-bromo-4-chloroindol-3-yl phosphate) в качестве хромогена или CDP-Star (disodium 4-chloro-3-(methoxyspiro(1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro) tricyc-lo[3.3.1.13,7]decan)-4-yl)phenyl phosphate) в качестве люминогенного субстрата щелочной фосфа-тазы.
Экстракция ДНК. Нити мха (5-10 г) с добавлением примерно 1 мл буфера для экстракции, содержавшего ЦТАБ (2% ЦТАБ (вес/объем), 100 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 20 мМ ЭДТА, рН 8.0, 14 М NaCl, 1%-ный (вес/объем) поливинилпирро-
лидон (ПВП) 40 000, 100 мМ дитиотрейтол (ДТТ), добавленный перед использованием буфера) на 1 г сырого веса тщательно растирали в ступке с жидким азотом. Полученный порошок переносили в 250-миллилитровый полиэтиленовый сосуд, содержавший 0.5 мл буфера для экстракции, содержавшего ЦТАБ, и 0.5 мл Н20 на 1 г сырого веса, предварительно нагретых до 50°С. После добавления 0.2 мл буфера, содержавшего ^лаурилсар-козин (100 мМ Трис-НС1, рН 8.0, 20 мМ ЭДТА, рН 8.0, 10%-ный (вес/объем) ^лаурилсаркозин (натриевая соль)) на 1 г сырого веса, сосуд помещали в водяную баню с температурой 50°С. Добавляли 5 мкл/г сырого веса раствора протеиназы К (20 мг/мл) и инкубировали смесь в течение 15 мин при периодическом легком помешивании. После переноса смеси в 50-миллилитровые конические пробирки проводили экстракцию равным объемом смеси хлороформа и изоамилового спирта (СНС13 : ИАС, 24 : 1) с последующим центрифугированием при 5000 g в течение 10 мин при комнатной температуре (КТ). Супернатант переносили в новые пробирки и осторожно смешивали с 0.1 объема 10 х ЦТАБ-буфера (10% ЦТАБ (вес/объем), 700 мМ ШС1). Процедуру повторяли; прозрачный супернатант переносили в новые пробирки; нуклеиновые кислоты осаждали 0.8 объемами изопропанола и немедленно центрифугировали при 4000 g в течение 5-10 мин при КТ. Осадок промывали в течение 10 мин ледяным 75%-ным этанолом. После центрифугирования при 4000 g в течение 5 мин при 4°С этанол удаляли. Следы этанола удаляли пипеткой после второго центрифугирования в течение нескольких секунд. Нуклеиновые кислоты растворяли в 0.5 мл ТЭ-ДТТ (100 мМ ДТТ, 10 мМ Трис-НС1; рН 8.0, 1 мМ ЭДТА) на г сырого веса. Добавляли РНКазу А до конечной концентрации 10 мкг/мл и инкубировали смесь при 37°С в течение 30 мин. Смесь еще раз осторожно, но тщательно экстрагировали смесью фенола, хлороформа и ИАС (25 : 24 : 1) и центрифугировали 5 мин при КТ при 5000 g. Супернатант переносили в новую пробирку. После экстракции СНС13/ИАС и центрифугирования 5 мин при 5000 g КТ супернатант переносили в новую пробирку. К супернатанту добавляли 5 М №С1 до конечной концентрации 1.25 М и равный объем (общий объем, считая №С1) водонасыщенного ди-этилового эфира и осторожно, но тщательно перемешивали смесь. Фазы разделяли центрифугированием при 5000 g при КТ в течение 10 мин. Супернатант (эфирная фаза) осторожно удаляли, а водную фазу фильтровали через стеклянную вату. Добавляли 2.5 объема ледяного 96%-ного этанола, и ДНК осаждали центрифугированием при 5000 g в течение 5 мин при 4°С. Осадок промывали большим объемом 75%-ного этанола, оставляя при -20°С, по меньшей мере, на 1 ч или на ночь. После центрифугирования при 5000 g в
636 M
МИТМАН и др.
д е М 123456789 10 М
Рис. 2. ПЦР разных образцов ДНК (10 нг каждый), выделенных предложенным нами методом из разных линий Ceratodon.
1-9 - продукт амплификации размером 2.3 т.п.н. на ДНК из растений дикого типа; 10 - линия с выключенным соответствующим геном. М - ДНК маркер 1 т.п.н.
Рис. 1. Электрофорез разных количеств суммарной ДНК Ceratodon в агарозном геле. а-в - нерестриктированная ДНК, выделенная предложенным нами методом; г-е - ДНК, выделенная модифицированным методом Rogers и Bendich. М - ДНК маркер 1 т.п.н. ("New England Biolabs", Великобритания).
течение 5 мин при 4°С супернатант отбрасывали. Следы этанола удаляли пипеткой после дополнительного краткосрочного центрифугирования. Осадок ДНК растворяли в 0.1 мл ТЭ/г сырого веса.
РЕЗУЛЬТАТЫ
При исп
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.