МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 4, с. 425-432
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 577.152.314
ПРЕПАРАТЫ СЕКРЕТИРУЕМОЙ РНКазы BACILLUS PUMILUS: ОДИН ФЕРМЕНТ ИЛИ ДВА?
© 2015 г. В. В. Ульянова1, В. С. Ходжаева, Е. В. Дудкина, А. В. Лайков, В. И. Вершинина, О. Н. Ильинская
Казанский (Приволжский) федеральный университет, Институт фундаментальной медицины
и биологии, кафедра микробиологии Поступила в редакцию 13.08.2014 г.
Проведен иммунохимический анализ очищенных препаратов РНКазы Bacillus pumilus (биназы), представленных ферментом заводского производства (Институт органического синтеза, Рига, Латвия), ферментами, выделенными из культуральной жидкости нативного штамма-продуцента В. pumilus и рекомбинантного штамма Escherichia coli BL21, несущего плазмиду pGEMGX1/ent/Bi. Установлено, что при электрофорезе всех трех образцов очищенной биназы обнаруживаются две белковые фракции, обладающие рибонуклеазной активностью. Определена молекулярная масса фракций — соответственно, около 12 и 25 кДа. Исключена возможность присутствия в препаратах второй секретируемой РНКазы В. pumilus — биназы II. Как низкомолекулярный, так и высокомолекулярный белки взаимодействовали со специфическими антителами к биназе в реакции имму-ноблоттинга, что указывает на их антигенную идентичность. Различие в молекулярной массе исследуемых белков свидетельствует о том, что биназа в растворе может быть представлена двумя формами — мономером и димером.
Ключевые слова: Bacillus pumilus, РНКаза, биназа, биназа II, иммунная диффузия, иммуноблоттинг.
DOI: 10.7868/S0026365615040175
Микробные рибонуклеазы (РНКазы) находят широкое применение в генной инженерии, биохимии и медицине. Особое внимание уделяется биологическим свойствам РНКаз, связанным с регуляцией экспрессии генов, ростом и диффе-ренцировкой клеток, защитой от патогенов, индукцией апоптоза. Цитотоксические эффекты микробных РНКаз по отношению к раковым клеткам, а именно биназы — секретируемой РНКазы Bacillus pumilus (ранее вид B. intermedius [1]), барназы из B. amyloliquefaciens [2], РНКазы Sa3 из Streptomyces aureofaciens CCM 3239 [3], риботок-сина а-сарцина из грибов рода Aspergillus [4], позволяют считать РНКазы микроорганизмов перспективными объектами для создания новых противоопухолевых препаратов [5—9]. В настоящее время также показано, что биназа обладает противовирусным эффектом [10], мутагенными [11, 12] и антимутагенными свойствами [13]. Для разработки препаратов на ее основе, прежде всего, необходим гомогенный высокоочищенный белок.
Изучены особенности регуляции биосинтеза биназы как в нативных, так и в рекомбинантных штаммах [14—17]. Показано, что фермент секре-тируется в окружающую среду в стадию замедления
1 Автор для корреспонденции (e-mail: ulyanova_vera@mail.ru).
роста культуры. Экспрессия его гена усиливается при недостатке в среде неорганического фосфата путем взаимодействия регулятора транскрипции PhoP, контролирующего специфический ответ клеток бацилл на фосфатное голодание, с промотором гена РНКазы [14]. На основе этих данных разработаны методы выделения фермента [18]. Однако известно, что В. pumilus обладает еще одной РНКазой, которая может секретироваться в среду. Это менее изученная рибонуклеаза — биназа II с молекулярной массой 29 638 Да (Mr биназы 12212 Да), активируемая Mg2+, однако также представляющая собой щелочной белок с оптимумом действия при рН 8.5 [19]. В связи с этим встает вопрос, насколько гомогенны получаемые препараты биназы.
Целью настоящей работы стала оценка гомогенности препаратов РНКазы, выделенных из культуральной жидкости В. pumilus и рекомбинантного штамма Escherichia coli BL21, несущего плазмиду pGEMGX1/ent/Bi, в сравнении с препаратом биназы, полученной в производственных условиях в Институте органического синтеза (Латвия).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы бактерий. Использовали штаммы бактерий из музея кафедры микробиологии Казанского федерального университета. Для получения биназы выращивали штамм В. pumilus 7P на среде, содержащей (%): 2.0 — пептона, 1.0 — глюкозу, 0.01 - CaCl2, 0.03 - MgSO4 • 7H2O, 0.3 - NaCl, 0.01 -MnSO4; pH 8.5, при 37°С до поздней логарифмической фазы [20]. Для получения биназы II в тех же условиях выращивали штамм B. subtilis 3922 с плазмидой pJF28, несущей ген рибонуклеазы под собственным промотором [21]. Рекомбинантный штамм E. coli BL21 pGEMGX1/ent/Bi культивировали, как описано ранее [22]. В данном штамме структурный ген биназы расположен на плазмиде pGEMGX1/ent/Bi, его экспрессия контролируется T7 промотором, синтезируемый белок направляется в окружающую среду с помощью сигнального пептида щелочной фосфатазы PhoA.
Препараты РНКаз. Для исследования были взяты три образца биназы: (1), полученный ранее в Институте органического синтеза (Рига, Латвия); (2), выделенный нами из культуральной жидкости рекомбинантного штамма E. coli BL21 pGEMGX1/ent/Bi; и (3) - из культуральной жидкости В. pumilus 7P. Выделение и очистку РНКаз проводили согласно процедуре, описанной Макаровым с соавт. [23]. Каталитическая активность препаратов была подтверждена по отношению к высокополимерной дрожжевой РНК ("Вектор", Бердск) [12]. За единицу активности принято возрастание на 1 единицу оптической плотности (260 нм) кислоторастворимых продуктов гидролиза РНК при 37°С за 1 мин.
Химический димер биназы, полученный в результате ковалентной сшивки белка с помощью диметилсуберимидата [24], был любезно предоставлен к.х.н. Н.В. Калачевой (Казанский федеральный университет).
Биназа II была получена из культуральной жидкости B. subtilis 3922 pJF28 согласно методике, описанной ранее [21].
Электрофоретический анализ. Электрофорез белков в ПААГ в присутствии 0.1% додецилсуль-фата натрия проводили по стандартной методике Лэммли [25]. Рибонуклеазную активность выявляли методом зимографии, с этой целью в разделяющий гель для электрофореза добавляли в качестве субстрата высокополимерную РНК дрожжей Torula в концентрации 7 мг/мл ("Sigma", США). После электрофореза для удаления доде-цилсульфата натрия гель промывали буфером, содержащим 10 мМ трис-HCl, 20% изопропанол, pH 7.5. Ренатурацию белков проводили, последовательно инкубируя гель в течение 10 мин в 10 мМ трис-HCl, pH 7.5 и 100 мМ трис-HCl, pH 7.5. Зоны гидролиза РНК выявляли после окрашивания
геля в течение 10 мин 0.2% толуидиновым синим ("Sigma", США).
Получение поликлональной сыворотки. В работе использовали поликлональную сыворотку к биназе, полученную иммунизацией кроликов коммерческим препаратом фермента. Курс иммунизации состоял из 4 подкожных инъекций с интервалом 10—12 дней смесью возрастающих концентраций белка (1, 2, 4, 8 мг) в комплексе с полным (первая и вторая инъекции) и неполным (третья и четвертая инъекции) адъювантом Фрейнда. Через 30 дней для проведения ревакцинации подкожно вводили 10 мг растворимого белка. Сыворотку получали через 10—12 дней после ревакцинациии и использовали для выделения специфических антител.
Иммунохимический анализ качества полученной сыворотки проводили с помощью реакции преципитации в агаровом геле [26]. Для постановки реакции использовали 1% агар Дифко в физиологическом растворе. О наличии антител в сыворотке судили по появлению линий преципитации.
Получение специфических антител. Для выделения из поликлональной сыворотки специфических антител к биназе использовали CNBr-активи-рованную сефарозу 4В ("Sigma", США). Сорбент предварительно промывали на стеклянном фильтре 0.1 н раствором HCl, затем 0.1 М NaHCO3 буфером (pH 8.3) и 0.5 М раствором NaCl. Отмытую сефарозу смешивали с раствором биназы (1) в концентрации 2 мг/мл и инкубировали 2 ч при комнатной температуре. Не связавшийся фермент отмывали на стеклянном фильтре 0.5 M раствором NaCl под контролем оптической плотности. Иммунную сыворотку кролика, содержащую антитела к биназе, смешивали с равным объемом 0.2 М трис-HCl буфера (pH 7.5) и инкубировали с аффинным сорбентом в течение 3 ч при комнатной температуре. Связавшиеся специфические антитела элюировали 0.05 М глицин-HCl буфером (pH 2.8), элюат нейтрализовали NaOH. Фракции, содержащие антитела, анализировали в реакции двумерной иммунодиффузии. Иммунологически активные фракции объединяли и использовали для постановки иммуноблоттинга.
Иммуноблоттинг. Проводили электроперенос белков, фракционированных в 15%-ПААГ, на нитроцеллюлозную мембрану. Оставшиеся центры связывания блокировали раствором 1% обезжиренного молока (в трис-солевом буфере, рН 7.4), и вносили специфические первичные антитела к биназе. Отмывали мембрану от не связавшихся антител и инкубировали 1.5 ч в растворе вторичных антител. Использовали антикроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена ("Sigma", США). Детекцию образованных иммунных комплексов проводили хемилюминес-
ПРЕПАРАТЫ СЕКРЕТИРУЕМОЙ РНКазы BACILLUS PUMILUS
427
Рис. 1. Электрофореграмма (а) и зимограмма (б) очищенной биназы. М — маркерные белки; 1, 2 — биназа из рекомби-нантного штамма E. coli (2), количество белка в образце 5 мкг; 3, 4 — коммерческий препарат биназы (1), количество белка в образце 15 мкг; 5, 6 — биназа из культуральной жидкости исходного продуцента B. pumilus (3), количество белка в образце 10 мкг. Количество белка на зимограмме (б) 10 мкг.
центным способом. Проявление мембраны осуществляли с помощью системы гель-документации ChemiDoc ("Bio-Rad", США).
Высокоэффективная жидкостная хроматография и масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС). Белки, соответствующие двум фракциям, вырезали из полиакриламидного геля, окрашенного Кумасси R250. Для удаления красителя фрагменты промывали ацетонитрилом и 200 мМ NH4HCO3, смешанными в соотношении 1 : 1. Белки расщепляли трипсином ("Promega", США) в течение ночи при 37°C. Полученные пептиды экстрагировали с помощью 0.1% трифторуксусной кислоты и высушивали в вакуумном концентраторе. Идентификацию пептидов проводили с использованием системы ВЭЖХ-МС ("Bruker", ФРГ).
Моделирование и сопоставление структур.
Сравнение первичных структур биназы I (GenBank P00649.3) и биназы II (GenBank CAA66713.1) проводили с помощью алгоритма "Muscle" (http://www.ebi.ac.uk
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.