ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 5, с. 676-680
^ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^
СТАТЬИ
УДК 581.1
ПРЕВРАЩЕНИЕ ЧЕТВЕРТИЧНЫХ АММОНИЕВЫХ СОЕДИНЕНИЙ В СИСТЕМЕ ЦЕЛОГО РАСТЕНИЯ У ГАЛОФИТА Suaeda altissima
© 2014 г. Г. Ф. Хайлова*, Л. Г. Попова*, Л. Г. Халилова*, Н. А. Мясоедов*, Ю. В. Балнокин*, **
*Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва **Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва Поступила в редакцию 10.02.2014 г.
У галофита Suaeda altissima (L.) Pall., выращенного при разных концентрациях NaCl в питательном растворе (1, 50, 100, 250 мМ), в корнях, листьях и пасоке определяли общее содержание четвертичных аммониевых соединений (ЧАС) и содержание холина. Полученные результаты позволили оценить содержание глицинбетаина (ГБ) в органах и в пасоке S. altissima, рассчитанное как разность между общим содержанием ЧАС и содержанием холина. В корнях наибольший вклад в общее содержание ЧАС вносил холин (от 69 до 96% при разных концентрациях NaCl в питательном растворе), тогда как в листьях на долю холина приходилось лишь 12—23%. Вклад холина в суммарное содержание ЧАС в пасоке при разном уровне засоления составил 84—90%. Сделано заключение, что у S. altissima холин синтезируется в основном в корнях и с транспирационным током поступает в листья, где используется как субстрат для синтеза ГБ. По мере повышения концентрации NaCl в питательном растворе содержание холина в корнях и содержание ГБ в листьях возрастало до уровней, вносящих заметный вклад в поддержание осмотического баланса в цитоплазме клеток S. altissima при засолении.
Ключевые слова: Suaeda altissima — галофит — холин — глицинбетаин — локализация в органах — засоление — осмотический баланс
DOI: 10.7868/S0015330314050091
ВВЕДЕНИЕ
У растений в стрессовых условиях важную защитную роль играют так называемые совместимые вещества (compatible solutes). Это органические вещества с небольшими молекулярными массами, хорошо растворимые в воде и не токсичные в высоких концентрациях для биологических макромолекул. Одним из таких веществ является глицинбетаин (ГБ), относящийся к классу четвертичных аммониевых соединений. ГБ обнаружен у представителей ряда семейств: Amaran-thaceae, Acanthaceae, Chenopodiaceae, Malvaceae, Poaceae и Rosaceae. Клетки гликофитов в норме содержат ГБ в небольших количествах, обычно не превышающих нескольких мкмоль/г сырой массы. Содержание ГБ возрастает в несколько раз в стрессовых условиях, в частности при почвенном
Сокращения: ГБ — глицинбетаин; ЧАС — четвертичные аммониевые соединения.
Адрес для корреспонденции: Попова Лариса Геннадьевна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Факс: 007 (499) 977-8018; электронная почта: lora_gp@mail.ru
засолении, водном дефиците и низких температурах. У галофитов содержание ГБ в клетках выше, чем у гликофитов, и при стрессах достигает нескольких десятков мкмоль/г сырой массы [1].
Большое число исследований посвящено протекторным функциям глицинбетаина в условиях абиотических стрессов. В частности, показано защитное действие ГБ на фотосинтетический аппарат растений при избыточном освещении, почвенном засолении, осмотическом стрессе, засухе, низких положительных и отрицательных температурах [1]. В условиях стресса ГБ может оказывать также прямое защитное действие на высокоорганизованные структуры, такие как клеточные мембраны. Например, ГБ защищает локализованные в плазматической мембране белки, препятствуя утечке ионов К+ из клеток [2].
В ранних работах большое внимание уделялось глицинбетаину как осмолиту. Действительно, содержание ГБ в клетках возрастает в условиях засоления или засухи, когда водный потенциал среды снижается [3—6]. Однако часто, особенно у гликофитов, ГБ не накапливается до осмотиче-
ПРЕВРАЩЕНИЕ ЧЕТВЕРТИЧНЫХ АММОНИЕВЫХ СОЕДИНЕНИЙ
677
ски значимых концентраций [1], что у гликофитов свидетельствует скорее о его защитных функциях, чем об участии в осморегуляции.
Пути биосинтеза глицинбетаина в растениях хорошо изучены. Предшественником ГБ является холин, который образуется путем декарбокси-лирования серина до этаноламина [7]. Последующее трехкратное метилирование N^-группы этаноламина приводит к образованию четвертичного аммония — (CH3)3—N+—R. Метилирование осуществляется S-аденозилметионин-зависимы-ми N-метилтрансферазами — ключевыми ферментами биосинтеза холина. Метилирование аминогруппы может осуществляться как на уровне непосредственно этаноламина, так и его фосфорного эфира — фосфоэтаноламина [5, 8—10]. Известно, что ферменты биосинтеза холина — этаноламинкиназа, фосфохолинфосфатаза и фосфоэтаноламин-^метилтрансфераза — локализованы в цитозоле [1]. Превращение холина в конечный продукт глицинбетаин осуществляется в две стадии: холинмонооксигеназа окисляет холин до бетаинальдегида, который затем окисляется до глицинбетаина НАД+-зависимой бетаи-нальдегид-дегидрогеназой [8, 10]. Очень мало сведений имеется о путях движения холина от мест, где он синтезируется, к местам, где используется в качестве субстрата для синтеза ГБ. Фос-фоэтаноламин и фосфохолин — интермедиаты биосинтеза холина, были обнаружены в пасоке пшеницы Triticum aestuvum, что указывало на возможную локализацию систем биосинтеза холина в клетках корня этого растения и на последующее поступление холина в побег [11].
В ряде работ была исследована внутриклеточная локализация систем биосинтеза ГБ. Ферменты обоих этапов превращения холина в глицинбе-таин у шпината и сахарной свеклы обнаружены в хлоропластах [12, 13], что подтверждает важную роль ГБ в защите фотосинтетического аппарата этих растений при стрессах. Однако у других растений, например у ячменя, холинмонооксигеназа в хлоропластах не была найдена [14].
Подавляющая часть сведений о путях биосинтеза ГБ, его внутриклеточной и тканевой локализации, а также о его физиологической роли у растений получена в опытах с надземными органами растений. Лишь единичные работы выполнены на корнях. Показано, что содержание ГБ в корнях, в частности у ячменя [15] и мангрового растения Avicennia nitida [16], существенно ниже, чем в надземных органах. В отличие от мезофилла листьев ячменя, где биосинтез ГБ является конститутивным, в клетках корня ячменя биосинтез ГБ индуцируется засолением. Индукция происходит в перицикле и клетках эпидермы.
В настоящей работе определяли, в каких органах синтезируются холин и ГБ у галофита Suaeda
altissima. Для этого в корнях, листьях и пасоке S. altissima измеряли содержание холина и общее содержание четвертичных аммониевых соединений, которое у ряда растений, в том числе у близкого вида S. monoica, согласно данным литературы, представлено в основном холином и ГБ [3, 4, 11]. Для выявления возможной индукции биосинтеза холина и ГБ хлористым натрием, а также для оценки вклада этих соединений в снижение осмотического потенциала клеток органов S. al-tissima при засолении измерения проводили на растениях, выращенных при разных концентрациях NaCl в питательном растворе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. Семена Suaeda altissima (L.) Pall. были собраны с растений, произраставших на берегу соленого озера Эльтон в Волгоградской обл. Семена проращивали во влажном песке при комнатной температуре, через три недели проростки пересаживали в 3-литровые стеклянные сосуды (по 4 растения на сосуд) на аэрируемый питательный раствор Robinson и Downton [17]. Дальнейший рост S. altissima проходил в фак-торостатной камере при 24°C в условиях водной культуры. Каждые две недели питательный раствор заменяли на свежий. Растения освещали натриевыми лампами высокого давления ДНаЗ/Re-flux 400 Вт (Россия) 16 ч в сутки при интенсивности света 150 Вт/м2. Через 7 дней после пересадки в питательный раствор вносили NaCl в конечных концентрациях 1, 50, 100 или 250 мМ. При концентрациях 100 и 250 мМ соль вносили дробно с инкрементом 50 мМ, чтобы избежать осмотического шока. В экспериментах использовали растения 60-65-дневного возраста.
Получение водных экстрактов из органов и сбор пасоки. Для определения содержания четвертичных аммониевых соединений (ЧАС) в органах S. altissima отбирали листья боковых побегов 3-5-го ярусов и боковые корни. Из листьев и корней ЧАС извлекали водной экстракцией, согласно прописи [11]. Для этого 500 мг высушенного при 80°С и гомогенизированного до порошкообразного состояния растительного материала суспендировали в 20 мл деионизованной воды. Суспензии взбалтывали на качалке в течение суток при 23—25°С, фильтровали, полученные фильтраты использовали для анализа. Сбор пасоки осуществляли при 24°С в течение суток после отделения надземных органов от корней. Пасоку и отфильтрованные водные экстракты, полученные из материала листьев и корней, замораживали и хранили при —20°С для последующего проведения анализов.
Определение суммарного содержания ЧАС и хо-лина в образцах осуществляли иодидным методом, согласно прописи [11]. Метод основан на
160 г 140
д л м g
п « 100 v о
ce ¡S
и
80 60 40 20 0
R2 = 0.964
: in in |П
R2 = 0.973
1 50 100 250
Концентрация №С1 в питательном растворе, мМ
Рис. 1. Общее содержание ЧАС (черные столбики) и содержание холина (серые столбики) в корнях 8. а1-tissima при разных концентрациях №С1 в питательном растворе.
способности всех ЧАС вступать в реакцию с йодом с образованием в кислой среде осадка окрашенных комплексных соединений — перйодидов. Холин, в отличие от других ЧАС, способен образовывать перйодиды в широком диапазоне рН от сильно кислых до сильно щелочных [18]. В связи с этим для определения суммарного содержания ЧАС рН образцов доводили приблизительно до 1.0, смешивая их с 2 N Н^04 в отношении 1 : 1. Для определения содержания холина вместо 2 N Н^04 использовали 40 мМ К,№-фосфатный буфер, рН 7.4. До стадии образования осадка все операции проводили при 4°С. Аликвоты образцов (500 мкл) вносили в стеклянные центрифужные пробирки, добавляли по 200 мкл реагента К1—12, который получали, растворяя 15.7 г 12 и 20 г К1 в 100 мл воды. Смесь инкубировали в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.