ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 6, с. 612-618
УДК 57.088.3
ПРИМЕНЕНИЕ ДИАГНОСТИКУМА НА ОСНОВЕ ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННЫХ УГЛЕРОДНЫХ НАНОЧАСТИЦ ДЛЯ МОНИТОРИНГА АФФИННОЙ ОЧИСТКИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
© 2014 г. П. В. Храмцов, М. С. Бочкова, М. Б. Раев
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, 614081 e-mail: khramtsovpavel@yandex.ru Поступила в редакцию 16.11.2013 г.
Исследовано применение диагностического реагента на основе углеродных наночастиц ковалентно функционализированных G-белком стрептококка для создания системы мониторинга и оптимизации технологии аффинной очистки поликлональных кроличьих антител к альфа-фетопротеину. Разработанная система позволяет за короткое время (45 мин) провести полуколичественную оценку содержания иммуноглобулина (IgG) большинства высших животных и человека в образце сыворотки крови и элюате. Чувствительность определения IgG при помощи диагностикума углерод—G-бе-лок составила 80 нг/мл. Разработаны подходы к стабилизации компонентов систем анализа, обеспечивающие сохранение их функциональных свойств при длительном хранении. Для диагностикума срок хранения составляет более 20 лет, для иммуносорбентов — более полутора лет. Разработана методика длительного хранения иммуносорбентов, использующихся в анализе. Применение тест-системы возможно без наличия регистрационной аппаратуры.
DOI: 10.7868/S0555109914060063
В настоящее время в лабораторной, клинической и биотехнологической практике увеличивается потребность в методах упрощенного тестирования, позволяющих получать точный результат анализа в предельно сжатые сроки. Принципы и методы, используемые в таких тестах, различны: это могут быть системы агглютинации окрашенных частиц, иммунохроматографические, имму-нофильтрационные, дот-блот методы. В большинстве случаев подобные тесты являются неинструментальными и могут применяться даже при отсутствии регистрационной аппаратуры и специалистов с высокой квалификацией.
В лаборатории экологической иммунологии УрО РАН разработан целый ряд таких тест-систем. Основу диагностического реагента в них составляют углеродные наночастицы, ковалентно конъюгированные с аффинными соединениями. Частицы углерода выполняют при этом функцию цветной метки, а аффинные соединения обеспечивают специфичность взаимодействия конъюга-та с аналитом. Углеродные диагностикумы применялись для создания систем качественного и полуколичественного экспресс-анализа антител к термостабильнному токсину Yersinia pseudotubercu-losis, столбнячному анатоксину, идентификации альфа-фетопротеина (АФП) и хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) [1—3]. В качестве аффинного компонента диагностикумов использовали G-белок стрептококка, стрептавидин, мо-
ноклональные антитела к гормонам беременности. Чувствительность этих систем лежит в диапазоне от 1.5 до 160 нг/мл [2, 4]. Чувствительность определения 1§О при помощи диагностикума уг-лерод-О белок составляла 80 нг/мл [5].
Потенциальная сфера применения углеродных конъюгатов не ограничивается рамками клинической диагностики.
Метод аффинной хроматографии является эффективным, широко используемым инструментом для получения препаратов иммуноглобулинов с высокой степенью очистки, применяющихся в самых различных целях: терапевтических, диагностических, исследовательских. Для проведения аффинной хроматографии используют как коммерческие, так и разработанные самостоятельно с учетом специальных требований и особенностей сорбенты и протоколы.
Разнообразны также и источники антител — гипериммунные сыворотки животных, асцитные жидкости, культуральные среды. Индивидуальные особенности организмов — продуцентов антител определяют необходимость подбора параметров хроматографической системы: скорость насыщения сорбента в отношении антилигандов, объем наносимой пробы, объемы элюирующих буферов и т.д. При использовании коммерческих наборов и при воспроизведении стандартных методик существует возможность с достаточной точностью математически рассчитать эти параметры, учитывая известные данные (емкость сор-
бента, примеры профилей элюции) от поставщиков и из протоколов.
В случае использования коммерческих сорбентов для решения нестандартных задач или при самостоятельном конструировании хроматографиче-ской системы, например, для выделения антител к редким или синтетическим антигенам, затруднительно точно предсказать свойства аффинного сорбента и его поведение в эксперименте. Более привлекательным решением является самостоятельная оценка динамики хроматографического процесса при помощи систем детекции иммуноглобулинов в элюате.
К таким системам относятся аналитические методы, позволяющие количественно или полуколичественно оценить содержание иммуноглобулинов необходимой специфичности в исходном материале и в пробах элюата. Эта информация делает возможной корректировку протокола хроматографии (изменение скорости элюции, исходного объема пробы, объема сорбента и т.д.), облегчает планирование последующих экспериментов.
Методы детекции антител в хроматографиче-ских пробах многочисленны, широко распространены инструментальные подходы, базирующиеся на применении считывающих устройств. К ним относятся иммуноферментный анализ (ИФА) [6—9], нефелометрия [10], биосенсоры [9]. В большинстве случаев применяется ИФА, поскольку он является рутинным лабораторным методом анализа и оборудование для него наиболее доступно. Традиционным неинструментальным методом является метод с использованием реакции иммуно-диффузии в геле агарозы [6, 11—14].
Испытание сконструированной системы осуществляли в ходе выделения кроличьих поликло-нальных антител к АФП человека.
Цель работы — разработка неинструментальной твердофазной дот-иммуноаналитической системы контроля хроматографического выделения иммуноглобулинов на основе углеродных наночастиц, функционализированных G белком стрептококка.
МЕТОДИКА
Приборы и материалы. В работе использовали хроматографическую колонку 1.5 х 12 см ("BioRad", США), перистальтический насос Pump P-1, проточный УФ-спектрометр 2138 Uvicord S "Pharmacia LKB" (Швеция), ультразвуковой дезинтегратор Soniprep 150 Plus ("MSE", Англия), при-борно-аппаратный комплекс для измерения размеров частиц Zetasizer NanoZS ("Malvern", Англия), сканирующий электронный микроскоп NOVAsem 600 ("FEI", США), ячейку ультрафильтрационную Amicon stirred cell 8050 ("Millipore", Германия), центрифугу 5804 R ("Eppendorf", Германия).
Реагенты и буферные растворы. Реагенты: бромциан-активированная сефароза 4B, сефаро-за CL-6B "Pharmacia Fine Chemicals" (Швеция), АФП "Биалекса" (Россия), белые полистироль-ные планшеты для серийных разведений "Linbro" (США), агар "Difco" (США), нитроцеллюлозная мембрана с диаметром пор 0.45 мкм "Bio-Rad" (США), бычий сывороточный альбумин (БСА), IgG человека, G-белок стрептококка "Sigma" (США), глутаровый альдегид "AppliChem" (Германия), толуол "Экрос" (Россия), глицерин, твин-20 "Panreac" (Испания).
Растворы для иммуноанализа и синтеза диа-гностикума: 0.02 М карбонат-бикарбонатный буфер рН 9.6 (КББ); 0.15 М NaCl, забуференный 0.015 М Na-фосфатами, рН 7.25 (ЗФР); ЗФР, содержащий 0.05% твина-20 (ЗФРТ).
Растворы для хроматографии: 0.15 М NaCl; 0.1 М глицин-HCl рН 2.6; 0.5 и 0.15 М NaCl, забуферен-ные 0.03 М Na-фосфатами до рН 7.25 (0.15 М и 0.5 М ФБР). Все использованные растворы приготовлены на деионизированной воде.
Синтез диагностикума. В качестве источника углерода использовали сажу, полученную путем конденсирования из пламени горящего толуола. Ее подвергали многоэтапной отмывке в органических растворителях и фильтрации для удаления недоокисленных продуктов. Полученный аморфный углерод представлял собой матово-черный порошок, не растворимый в доступных растворителях. При помощи сканирующей электронной микроскопии установили, что форма углеродных частиц сферическая или близкая к сферической, а линейные размеры лежат в диапазоне 40—70 нм.
На следующем этапе синтеза суспендировали 1.0 г аморфного углерода в 19 мл 2% БСА в ЗФР в течение 1 сут при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке. Концентрация углерода в пересчете на сухое вещество составила 5%. Полученную суспензию подвергали ультразвуковой дезинтеграции при частоте 22 кГц. Общее время озвучивания составило 1 ч. С целью удаления оставшихся крупных частиц озвученную суспензию центрифугировали 5 мин при 1620 g [15].
Супернатант инкубировали в течение 40 мин при комнатной температуре с равным объемом 25%-ного раствора глутарового альдегида. После чего смесь центрифугировали 5 мин при 1620 g и проводили хроматографию на колонке с сефаро-зой CL-6B для удаления не связавшегося БСА и глутарового альдегида. Вышедшие в холостом объеме фракции объединяли и концентрировали до исходного объема углеродной суспензии в ультрафильтрационной ячейке [15].
Активированную глутаровым альдегидом суспензию объемом 4.5 мл инкубировали с 0.5 мл белка G с концентрацией 10 мг/мл в течение 100 минут при мягком перемешивании. Получен-
1 : 1
1 : 2
С
K-
Ov
1 : 16 1 : 8
1 : 4
1 : 8
Рис. 1. Полуколичественное определения титра антител к АФП в гипериммунной кроличьей сыворотке методом иммунодиффузии по Оухтерлони. В центральную лунку был внесен АФП в концентрации 125 мкг/мл, в лунках по краям — суммарная кроличья гипериммунная сыворотка в указанном разведении, К— лунка с сывороткой интактного кролика (отрицательный контроль).
ную суспензию центрифугировали 5 мин при 1620 g. Несвязавшийся белок G удаляли гель-хроматографией на колонке с сефарозой CL-6B. Фракции, вышедшие в свободном объеме и содержащие конъюгат, объединяли, добавляли БСА и глицерин до конечной концентрации 1 и 20% соответственно [15].
Размер частиц конъюгата определяли методом измерения обратного динамического светорассеяния под углом 173° при помощи программно-аппаратного комплекса Malvern Zetasizer NanoZS (Англия). Для измерения конъюгат разводили в воде до концентрации углеродных частиц 0.01%. Диаметр 90% частиц находился в диапазоне 70— 200 нм, преобладали частицы диаметром 90—100 нм.
Синтезированный конъюгат хранили при температуре 2—8°С. Такой темп
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.