ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2014, том 459, № 6, с. 754-758
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 575.17:597.553.2
ПРИМЕНЕНИЕ ISSR-МАРКЁРОВ ДЛЯ КАМЧАТСКИХ ПОПУЛЯЦИЙ МИКИЖИ PARASALMO (ONCORHYNCHUS) MYKISS (WALBAUM) (SALMONIDAE, SALMONIFORMES) © 2014 г. М. Н. Мельникова, А. Л. Сенчукова, С. Д. Павлов
Представлено академиком Ю.Ю. Дгебуадзе 06.08.2014 г. Поступило 06.08.2014 г.
DOI: 10.7868/S0869565214360249
Тихоокеанские благородные лососи рода РагазаЫо (Опсогкупскш) имеют широтное амфи-пацифическое распространение, демонстрируют высокий уровень вариаций поведенческих, морфологических и экологических особенностей, которые формируют широкий ряд жизненных стратегий и внутривидовых форм. Вид микижа РагазаЫо (Опсогкупскш) шуШзз является одним из интереснейших представителей этого рода, демонстрирующим высокую адаптивность, морфологическую пластичность и исключительно широкое распространение. В азиатской части ареала микижа вызывает особый научный и практический интерес, так как здесь вид представлен в основном дикими популяциями, сохранившими свою первозданную популяционную структуру. Это делает лососей уникальным объектом для изучения проблем происхождения, формирования структуры диких популяций, механизмов микроэволюции и процессов видообразования. Важной особенностью камчатской группы популяций микижи является обедненность генома на азиатской части ареала [1] и малое число эффективных популяционно-генетических маркёров. Филогенетическая подразделенность популяций камчатской микижи исследовалась мало и в основном данным коллективом авторов. В предыдущих работах удалось получить географическую дифференциацию с помощью аллозимов [2], созданных в нашей лаборатории SCAR-маркёров [3] и анализа микросателлитных локусов [4]. Настоящее исследование направлено на разработку новых методик и увеличение числа таких популя-ционно значимых генетических маркёров за счет анализа малоизученных участков ДНК.
Высокой вариабельностью, которую можно использовать при популяционном анализе, обла-
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Институт экологиии и эволюции им. А.Н. Северцова Российскойй Академии нак, Москва
дают локусы межсателлитной ДНК (ISSR-PCR-inter-microsatellite-PCR). Этот метод прочно вошел в практику мультилокусного картирования генома с 1994 г. [5]. Метод обладает высокой разрешающей способностью и используется в фило-генетике главным образом на уровне популяций и близкородственных видов [6]. Для изучения по-пуляционно-генетических отношений камчатской микижи этот метод не применялся. Ранее в нашей лаборатории были созданы семь оригинальных ISSR-маркёров специально для данного вида рыб [7]. В настоящей работе оценивали эффективность применения этих маркёров для генетической дифференциации камчатских популяций микижи.
Исследование проводили на том же материале (табл. 1), который был использован в предыдущей работе по SCAR-маркёрам [3].
Методика выделения ДНК, тест на ее количество и качество, подбор ISSR-праймеров и условия ПЦР подробно описаны нами в методической работе по разработке ISSR-маркёров [7]. Воспроизводимость результатов из опыта в опыт проверяли три раза на семи парах праймеров. При использовании реагентов для амплификации одной и той же фирмы результаты воспроизводились в 100% случаев.
Оценку частот нуль-аллелей рассчитывали по формуле Л.А. Животовского для диплоидных объектов, исследованных мультилокусными доминантными ДНК-маркёрами [8]. Аллельное разнообразие оценивали согласно руководству Вейра [9]. Статистическую ошибку, дисперсию и критерий t Стьюдента рассчитывали, следуя обычным рекомендациям [10]. Степень дифференциации популяций (9st, [9]) оценивали с помощью программы GDA [11]. На основе матрицы коэффициентов попарного сходства определяли координаты каждой выборки в пространстве главных компонент изменчивости по программе Statistica 10. Дендрограмма была построена на основании
Таблица 1. Исследуемые образцы ДНК P. (O.) mykiss и O. masou
№ Локальность Вид Форма Количество образцов
1 р. Сопочная, западное побережье Камчатки Parasalmo (O.) mykiss Объединенная выборка 25
2 р. Утхолок, западное побережье Камчатки Parasalmo (O.) mykiss Объединенная выборка 53
3 р. Двухюрточная, восточное побережье Камчатки Parasalmo (O.) mykiss Резидентная 15
4 р. Еловка, восточное побережье Камчатки Parasalmo (O.) mykiss Резидентная 6
5 р. Тигиль, западное побережье Камчатки Parasalmo (O.) mykiss Резидентная 11
6 р. Седанка, западное побережье Камчатки Parasalmo (O.) mykiss Резидентная 33
7 р. Быстрая, восточное побережье Камчатки Parasalmo (O.) mykiss Резидентная 10
8 Чили, Hatchery Parasalmo (O.) mykiss Рыборазводная 13
9 Чили, Canalal River Parasalmo (O.) mykiss Эстуарная 13
10 Чили, Gala River Parasalmo (O.) mykiss Эстуарная 10
11 р. Коль, западное побережье Камчатки Oncorhynchus masou Проходная 15
12 Северная Америка (Quinault River, Chilliwaсk River, Sacramento River) Parasalmo (O.) mykiss Линия coastal 15
13 Северная Америка (Dworshak Hatchery, Crystal Lake Hatchery) Parasalmo (O.) mykiss Линия inland 10
14 р. Жупанова, восточное побережье Камчатки Parasalmo (O.) mykiss Резидентная 27
Таблица 2. Средняя гетерозиготность и значимость различий у исследуемых популяций микижи
№ Значения p Ср. гет. Ошибка
поп. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
1 0 0.146 0.114
2 0.215 0 0.118 0.069
3 0.060 0.237 0 0.158 0.154
4 0.245 0.354 0.196 0 0.221 0.284
5 0.193 0.350 0.128 0.092 0 0.190 0.193
6 0.036* 0.194 0.093 0.268 0.225 0 0.141 0.097
7 0.242 0.373 0.185 0.029* 0.068 0.270 0 0.211 0.239
8 0.211 0.383 0.140 0.091 0.005* 0.246 0.066 0 0.191 0.178
9 0.237 0.410 0.164 0.073 0.027* 0.273 0.047* 0.023* 0 0.197 0.179
10 0.209 0.357 0.147 0.072 0.023* 0.240 0.046* 0.019* 0.002* 0 0.196 0.208
11 0.327 0.521 0.241 0.025* 0.091 0.369 0.009* 0.091 0.067 0.064 0 0.213 0.169
12 0.320 0.513 0.234 0.030* 0.085 0.362 0.003* 0.084 0.060 0.058 0.007* 0 0.212 0.169
13 0.300 0.451 0.232 0.006* 0.102 0.333 0.026* 0.101 0.080 0.077 0.022* 0.028* 0 0.219 0.213
14 0.078 0.314 0.004* 0.206 0.139 0.121 0.197 0.153 0.180 0.158 0.269 0.262 0.251 0.159 0.110
Примечание. * — p < 0.05; Ср. гет. — средняя гетерозиготность; нумерация популяций как в табл. 1.
частот нуль-аллелей, переработанных в таблицу генетических дистанций по Нею [12] с применением 100 повторов бутстрепа по методу иРОМЛ [13] с помощью программы РИуЦр 3.67.
Мы рассчитали аллельное разнообразие для семи 188Я-маркёров. Полученные величины средней гетерозиготности находились в пределах
от 0.118 (микижа из р. Утхолок) до 0.221 (микижа из р. Еловка), что свидетельствует о достаточной информативности используемых 188Я-маркёров (табл. 2). Ошибка находилась в интервале 0.069— 0.239, что демонстрирует их большую вариабельность. Статистически достоверные отличия (р < 0.05, табл. 2) были найдены между микижей из
Таблица 3. Оценки внутри- и межрегиональной дифференциации популяций микижи (проценты, в единицах В^)
Регион Сима Восточное побережье Камчатки Западное побережье Камчатки Америка Чили
Внутрирегиональная дифференциация
29% 7.5% 3% 2.8%
Межрегиональная дифференциация
Восточное побережье Камчатки 50% -
Западное побережье Камчатки 37.5% 19% -
Америка 45% 22.6% 14.6% -
Чили 40% 29% 24.8% 16% -
Примечание. Для каждой пары сравниваемых регионов, представленных несколькими выборками, были оценены все попарные значения 98( [9] и затем усреднены.
р. Сопочная и рек Седанка, Двухюрточная, Жупа-нова, Еловка и Быстрая, между микижей из р. Быстрая и североамериканскими популяциями, между микижей из р. Тигиль и чилийскими популяциями, микижей из р. Быстрая и двумя чилийскими популяциями микижи, между чилийскими популяциями микижи, а также между двумя формами inland и coastal североамериканских популяций микижи. Сима, использованная в качестве репера, имеет достоверные отличия от популяций микижи из рек Еловка и Быстрая и североамериканских популяций.
Величина межпопуляционной дифференциации, измеряемая показателем 9ST (аналог FST, [9]), определяет долю межпопуляционной изменчивости в общей изменчивости. В среднем по всем ло-кусам она принимала значение 33.5%, выступая статистически значимой величиной, что указывает на значительную дифференциацию популяций микижи по изученным локусам (табл. 3, рис. 1).
Диапазон общих значений 9st, рассчитанных для микижи из всех исследованных регионов, лежит в интервале от 2.8 до 29%. По сравнению с чилийскими популяциями наибольший процент различий отмечается между популяциями микижи на западном и восточном побережьях Камчатки (24.8 и 29% соответственно). Существенные различия между западным и восточным регионами Камчатки (19%) подтверждают, что маркёры для географического разделения камчатских популяций были выбраны верно. Меньшие, но также достоверные значения 9ST отличали камчатские популяции микижи от североамериканских популяций (22.6% — для восточных и 14.6% — для западных). Также данные маркёры выявили дивергенцию чилийских популяций от североамериканских, равную 16%.
При определении уровня внутрирегиональной дифференциации популяций микижи выяснилось, что он крайне низок у чилийских и северо-
американских популяций (2.8 и 3.0% соответственно) и высок у камчатских популяций. У за-паднокамчатских популяций он достигает 7.5%, а на востоке — 29%. Такие коэффициенты дифференциации говорят о способности выбранных маркёров выявлять различия практически в каждой популяции камчатской микижи по отдельно взятой реке. Поскольку маркёры подбирали именно для камчатских популяций, то можно сказать, что результат достигнут. Наиболее высокий меж-популяционный процент различий восточнокам-чатских популяций (29%) показывает значительную дифференциацию этих популяций между собой и особенно выборки из р. Жупанова (рис. 1 и 2).
Отношения между изученными популяциями по полученным результатам наглядно продемонстрированы на графике в пространстве главных компонент (рис. 1а по первой и второй компон
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.