МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 79, № 6, с. 734-747
= ОБЗОР
УДК 579.25:579.266:579.69:57.025(047)
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ И МИКРОБИОЛОГИИ В ЭКОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ
ЦИАНОБАКТЕРИЙ © 2010 г. О. А. Кокшарова1
Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Поступила в редакцию 22.12.2009 г.
Обзор освещает достижения и имеющиеся проблемы в биотехнологии и экологии цианобактерий и рассматривает возможности применения методов молекулярной генетики и микробиологии для их решения. Цианобактерии, прокариоты и древние родственники хлоропластов, являются модельными организмами для изучения фотосинтеза, фиксации атмосферного азота, клеточного деления, получения водорода и при решении других фундаментальных и практических задач. Это обеспечивается легкостью их культивирования, высокой скоростью роста, возможностью получения синхронизированных культур, а также развитием большого количества разнообразных методов молекулярной генетики и микробиологии для различных штаммов цианобактерий. Эти методы позволяют глубже понять роль цианобактерий в различных экосистемах и использовать их потенциал в разнообразных прикладных проектах, таких как получение молекулярного водорода, продукция фикобилипротеинов и цианофицина, формирование наночастиц, удаление из окружающей среды тяжелых металлов, биодеградация субстратов, решение проблемы образования цианобактериальных токсинов в пресных водоемах и морских акваториях, получение продуктов, предназначенных для медицины и пищевой индустрии.
Ключевые слова: цианобактериальные токсины, фотопродукция водорода, цианобактериальные на-ночастицы, фикобилипротеины.
Цианобактерии — это фотоавтотрофные бактерии, которые содержат хлорофилл a и осуществляют фотосинтез сходным образом с высшими растениями. Эти удивительно неприхотливые микроорганизмы нуждаются лишь в солнечном свете, воде и воздухе. Небольшая часть клеток некоторых цианобактерий дифференцируется в гетероцисты, специализированные клетки, в которых происходит фиксация атмосферного азота (N2). Это один из немногочисленных путей введения атмосферного азота в биосферу нашей планеты. Цианобактерии стали привлекательным объектом молекулярно-генетиче-ских исследований, начиная с семидесятых годов двадцатого столетия, когда в пионерских работах, проведенных в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова в России было показано, что эти организмы способны к генетической трансформации экзогенной ДНК [1, 2]. В настоящее время во многих лабораториях по всему миру проводятся разнообразные микробиологические и генетические исследования цианобактерий, поскольку для них разработаны молекулярные методы и доступна информация о полных геномных последовательностях нескольких десятков цианобактериаль-
1 Адрес для корреспонденции (e-mail: OA-Koksharova@ram-bler.ru).
ных видов и штаммов (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 8иЙ15/§епот_аЬ1е.с§0. Для переноса их генов используются трансформация, конъюгация и электро-порация. Разнообразные методы мутагенеза позволяют изолировать многие типы мутантов. Гены-репортеры применяются для оценки уровня транскрипции индивидуальных генов и изучения транскрипции внутри индивидуальных колоний или внутри индивидуальных клеток в филаменте (цепочке клеток) нитчатых штаммов [3]. Информация о полных геномах цианобактерий позволяет проводить глобальные исследования генной экспрессии на транскрипционном и трансляционном уровнях [4—6].
В связи с меняющимися современными условиями развития нашего общества, все большее внимание исследователей занимают прикладные аспекты научной деятельности. В предлагаемом обзоре обозначены основные области развития биотехнологии цианобактерий, среди них получение биоводорода, использование природных продуктов, получаемых из цианобактерий, для медицины и питания, формирование наночастиц в клетках цианобактерий и многие другие.
Целью предлагаемого обзора является освещение современного уровня знаний в области исследований уникальных фототрофных микроорганизмов —
цианобактерий — методами молекулярной генетики и микробиологии для решения разнообразных экологических проблем и биотехнологических задач.
ЦИАНОБАКТЕРИИ И ОКРУЖАЮЩАЯ СРЕДА
Цианобактерии распространены в водных средах, включая морские, солоноватые и пресные воды, в почвах и обрастаниях камней, в особенности сырых поверхностей. Их можно найти и в некоторых экстремальных местах обитания, таких, как горячие источники и сильно щелочные озера. Цианобактерии формируют природные и искусственные симбиозы с водорослями, мхами, папоротниками, покрытосемянными растениями, цикадами и беспозвоночными (кораллами, губками, гидроидами) [7—16]. В ассоциации с грибами они формируют лишайники, которые помогают превратить камни в почву. Полагают, что цианобактерии были первыми поселенцами суши, обеспечивая физический и химический субстрат для последующего роста эукари-отических растений. Микроорганизмы, развиваясь в виде биопленок, синтезируют внеклеточные полимерные вещества, которые позволяют биопленке существовать как целостной структуре [17]. Эти биополимеры, продуцируемые водорослями и цианобак-териями, могут способствовать лучшему удержанию воды почвой и предотвращению эрозии [18]. Нитчатые азотфиксирующие цианобактерии применяют как биоудобрения на рисовых полях [19, 20].
Сброс промышленных, сельскохозяйственных и бытовых сточных вод, содержащих фосфаты и нитраты, приводит к загрязнению озер и прудов, что вызывает массовый рост цианобактерий ("цветение" водоемов) [21]. Поверхность воды становится мутной, что препятствует прохождению света на нижние уровни водоема. Часть цианобактерий отмирает, бактерии, которые их разлагают, используют имеющийся кислород, и рыба умирает от нехватки кислорода. Некоторые цианобактерии, участвующие в цветении водоемов, образуют токсины, которые делают воду непригодной для употребления [22, 23]. Эти токсины могут накапливаться в водных организмах и распространяться по трофическим цепям на более высокие уровни, затрагивая здоровье животных и человека [24]. Цианобактерии синтезируют гепатотоксины (микроцистины и нодуляри-ны), гепато- и цитотоксины (цилиндроспермопси-ны), нейротоксины (анатоксин-а, анатоксин-а(8), и сакситоксины), дерматотоксины, раздражающие токсины (липополисахариды) и другие морские биотоксины (аплисиатоксины, дебромоаплисиа-токсины, лингбиатоксин-а) [25—27].
Цианобактериальные гепатотоксины, часто присутствующие в пресноводных цветущих водоемах, являются гептапептидами — это микроцистины, в то время как в соленых водах распространен пентапеп-тид — нодулярин. Микроцистины были обнаружены у представителей цианобактериальных родов Ana-
baena, Anabaenopsis, Hapalosiphon, Microcystis, Nostoc, Planktothrix, Phormidium и Synechococcus [27]. Микроцистины являются циклическими гептапептидами с необычной химической структурой и некоторым количеством небелковых аминокислот [28]. Они имеют три вариабельные метильные группы. Метилирование является распространенной модификацией биологически активных природных пептидов, полагают, что оно способствует повышению стабильности пептида от протеолитической деградации [29, 30]. Микроцистины синтезируются нерибосо-мально большими ферментными комплексами, состоящими из пептидсинтетаз и поликитидсинтетаз [31]. Пептидсинтетазы, обеспечивающие нерибосо-мальный синтез пептидов, отличаются консервативной модульной структурой. Каждый модуль состоит из каталитических доменов, ответственных за аденилирование, образование тиоэфира и конденсацию специфических аминокислот [32]. Дополнительные домены, необходимые для модификаций аминокислотных остатков, таких как эпимериза-ция, гетероциклизация, окисление, форматирование, восстановление или N-метилирование, могут быть также включены в модуль [32—34]. Совокупно эти биосинтетические особенности приводят к высокому многообразию цианобактериальных микро-цистинов. В настоящее время известно более 60 изо-морф микроцистинов. Полностью определены нук-леотидные последовательности биосинтетических генных кластеров для Microcystis, Planktothrix, Ana-baena, Nodularia и Nostoc [27]. В Anabaena этот ферментный комплекс кодируется генным кластером, содержащим 10 генов (mcyA—J) [35]. Если известны гены, кодирующие биоактивные компоненты, можно с помощью направленного мутагенеза получить соответствующие мутанты с нарушенным биосинтезом этих веществ и попытаться изучить и понять функции этих метаболитов. В случае микроцисти-нов такие мутанты были получены путем инсерции или делеции mcy генов в штаммах M. aeruginosa и P.agardhii [31, 36—39]. С помощью инсерционного мутагенеза впервые было показано [31], что гены, кодирующие пептидсинтетазы, вовлечены в продукцию микроцистина и то, что один генный кластер ответствен за продукцию всех вариантов мик-роцистина в штамме Microcystis aeruginosa PCC 7806. Каково значение микроцистинов для цианобакте-рий, пока не ясно. Потеря всех микроцистинов в мутанте mcyB M. aeruginosa PCC 7806 [31] не влияла на рост мутантных клеток в различных световых лабораторных условиях при сравнении с клетками дикого типа [39]. Тем не менее, проведение сравнительного двумерного белкового электрофореза позволило обнаружить, что уровень белка MrpA в клетках дикого типа PCC 7806 был высоким, но этот белок не выявлялся в клетках мутанта mcyB [40]. Применение современных экспериментальных подходов, таких как транскриптомика и протеомика, в сочетании с генетическими методами могло бы помочь исследо-
ванию ключевых стадий биосинтеза цианобактери-альных токсинов.
Цианобактерии образуют небелковую аминокислоту ß-N-метиламин-Х-аланин (BMAA) [41]. Накапливаясь в критической концентрации, эта аминокислота может связываться с глутаматовым рецептором человека, что приводит к развитию таких болезней как амиотрофический латеральный склероз, болезни Альцгеймера и Паркинсона [41, 42]. Поскольку ранее глутаматовые рецепторы рассматривались в связи с передачей нервных сигналов только у млекопитающих, обнаружение глутамато-вых рецепторов у растений [43] и у циан
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.