СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ, 2011, том 25, № 4, с. 352-360
БИОСЕНСОРЫ
УДК 602.4:547.455.623:007.573.6
ПРИМЕНЕНИЕ НИЗКОСЕЛЕКТИВНЫХ МИКРОБНЫХ БИОСЕНСОРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ КОМПОНЕНТОВ В МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ ВОДНЫХ СРЕДАХ
© 2011 г. В. А. Арляпов, О. Н. Понаморева, С. В. Алферов, В. А. Алферов,
А. Н. Решетилов1
Тульский государственный университет, 300600, Тула, пр. Ленина, 92, E-mail: chem@tsu.tula.ru, 1Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, 142290, Московская обл., г. Пущино, пр-т. Науки, 5, E-mail: anatol@ibpm.pushchino.ru
Поступила в редакцию 10.08.2010 г.
Разработана автоматизированная многоканальная биосенсорная установка на основе иммобилизованных микроорганизмов G. oxydans, P. angusta и S. bayanus для селективной оценки содержания глюкозы, фруктозы, метанола и этанола в смеси этих веществ. Применение технологии искусственных нейронных сетей (ИНС) для обработки экспериментальных данных позволило осуществить селективный анализ в диапазоне концентраций от 1.00 до 5.00 мМ по каждому из компонентов с ошибкой не более 18%. Данный метод может быть использован для мониторинга биотехнологических процессов при производстве алкогольной продукции. Разработанный биосенсор может служить прототипом для создания опытных образцов приборов для серийного освоения и применения.
Ключевые слова: биосенсор, глюкоза, фруктоза, метанол, этанол, искусственная нейронная сеть.
ВВЕДЕНИЕ
Актуальной задачей для пищевой промышленности, биотехнологического производства, клинического анализа и многих других областей деятельности человека является селективная детекция широкого спектра органических соединений - спиртов и углеводов. Зачастую анализируемые вещества находятся в растворе одновременно, что затрудняет определение концентрации целевого вещества. Для устранения мешающего влияния посторонних соединений используют физико-химическое разделение смеси на компоненты. Недостатки такого подхода состоят в том, что из-за необходимости проведения предварительной пробоподготовки возрастает трудоемкость анализа и снижается производительность; кроме того, такие подходы непригодны для осуществления непрерывных измерений. Традиционные методы определения углеводов и спиртов либо отличаются недостаточной точностью, либо трудоемки, дороги и характеризуются длительным временем анализа (Сибирый и др., 2005). Наиболее часто концентрацию спиртов определяют при
помощи ареометра (спиртометра), однако этот метод является не селективным, так как наличие в растворе различных солей, углеводов и других примесей искажают результаты замера. Газовая хроматография, представляющая стандартный метод оценки спиртов, является довольно дорогостоящим методом и требует наличия квалифицированного персонала. Те же недостатки можно отнести и к методу высокоэффективной жидкостной хроматографии, используемой для определения глюкозы и других углеводов в водных растворах. Эти методы могут быть эффективно применены для контроля качества готовой продукции, однако они не могут быть использованы для экспресс-анализа ферментационных сред.
Таким образом, актуальным направлением исследований является разработка метода анализа, который позволил бы упростить и удешевить процедуру определения указанных компонентов без потери точности и специфичности, а так же обеспечить возможность их постоянного мониторинга в реальных объектах. Перспективным подходом является развитие биосенсорных технологий (Terry et al., 2005). К преимуществам биосенсо-
ров можно отнести короткое время ответа, портативность, удобство в работе, а также отсутствие специальных требований к приготовлению исследуемого образца (Racek, 1995).
Имеется значительное количество публикаций, посвященных многокомпонентному анализу с использованием биосенсоров (Racek, Musil, 1987; Stefan et al., 2000; Wadkins et al., 1998; Rowe-Taitt et al., 2000). Однако в большинстве случаев высокая селективность анализа достигается при помощи специального подбора биоматериала в рецеп-торных элементах.
В качестве биологической составляющей, обеспечивающей высокую селективность, часто используют антитела (Killard et al., 1995; Rowe-Taitt et al., 2000). Так, в работе (Rowe-Taitt et al., 2000) описан иммуносенсор для одновременной детекции шести биологически опасных веществ (в частности, токсинов) и бактерий. Интенсивность связывания антиген-антитело определяли оптическим способом (по флуоресценции антител при помощи прибора с зарядовой связью). Другим широко используемым высокоселективным компонентом являются ферменты (Jaffrezic-Renault et al., 2001; Wimmerova, Mzcholan, 1999; Palmisano et al., 2000; Решетилов и др., 1998). Так, в работе (Palmisano et al., 2000) описана измерительная система для одновременного определения глюкозы и лактата. Каждый сенсор представлен соответствующей оксидазой, иммобилизованной на поверхности амперометрического электрода. Тщательно подобранные мембраны с иммобилизованным ферментом позволили создать измерительную систему, практически свободную от интерференции. В работе (Решетилов и др., 1998) была исследована возможность детекции этанола в присутствии глюкозы как мешающего субстрата при помощи измерительной системы, состоящей из микробного сенсора на основе иммобилизованных бактерий Gluconobacter oxydans и ферментного глюкозоанализатора "Эксан-Г". Исследованы области линейности и аддитивности откликов микробного сенсора. Возможным способом повышения селективности может быть использование генетически модифицированных микроорганизмов, у которых блокированы специфические рецепторы или встроены плазмиды биодеградации целевого субстрата (Aravanis et al., 2001; Bo-ronin et al., 1984).
Основным недостатком описанных выше измерительных систем является использование дорогостоящих высокоселективных сенсоров, позволяющих определять отдельные компоненты исследуемой смеси. Эффективным решени-
ем этой проблемы может служить использование только микробных клеток в рецепторных элементах биосенсоров. Микробные сенсоры обладают высокой чувствительностью, не уступающей чувствительности ферментных сенсоров, и часто превосходят последние по стабильности. Кроме того, микробные сенсоры обладают рядом других преимуществ (простота получения биомассы, наличие готовых ферментных комплексов внутри клетки). Однако для биосенсоров на основе целых клеток характерна широкая субстратная специфичность - чувствительность к большому количеству веществ ^'Боига, 2001). Для преодоления данного недостатка предлагается использовать набор сенсоров с различающимися характеристиками и обработку данных с использованием искусственных нейронных сетей. Применение ИНС для решения ряда научных и практических задач в настоящее время происходит с возрастающей интенсивностью (У1а80У et а1., 2005; Frossyniotis et а1., 2008). Существование множества топологий нейронных сетей и алгоритмов обучения позволяет легко адаптировать данный инструмент для решения огромного количества задач и прежде всего для анализа и обработки данных, полученных в ходе исследования, эксперимента или при мониторинге технологических процессов.
В настоящей работе выполнен анализ двух-, трех- и четырехкомпонентных смесей, содержащих глюкозу, фруктозу, метанол и этанол с использованием кислородного электрода типа Кларка и неселективных иммобилизованных дрожжевых и микробных клеток.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Биосенсорные измерения. В работе использовали многоканальный биосенсорный анализатор проточно-инжекционного типа "Мультибио-01", управляемый при помощи персонального компьютера. Для регистрации и обработки сигналов сенсоров использовали специализированное программное обеспечение Вш1ап-1011 (Кронас, Россия). Датчиками являлись кислородные электроды Кларка с иммобилизованными клетками микроорганизмов. Средняя величина тока, соответствующая содержанию кислорода в дистиллированной воде 9.2 мг/дм3, составляла 30 нА при шуме ±0.25 нА.
Все измерения проводили в проточном режиме при скорости протока 0.5 см3/мин, объем отбираемой пробы 300 мкл. Первичная обработка данных включала сглаживание и последующее дифферен-
цирование кривой I(t). Ответ сенсора вычислялся как максимальная скорость изменения силы тока от времени. Для измерений использовали натрий-калиевый фосфатный буфер (рН 6.8), концентрация солей составляла 20 мМ. Пробы вводили автоматическими микропипетками переменного объема (200-1000 мкл, 20-200 мкл, 0.5-10 мкл) (Biotech, США).
Культивирование клеток микроорганизмов.
Бактериальный штамм Gluconobacter oxydans sub-sp. industrius ВКМ B-1280 (далее G. oxydans) был получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (Пущино). Клетки выращивали в жидкой среде аэробно 18-20 ч в качалочных колбах объёмом 500 мл при температуре 28 °С в среде следующего состава: сорбит - 200 г/дм3, дрожжевой экстракт - 20 г/дм3, дистиллированная вода - 100 см3. Посевной материал выращивали аналогично 24 ч. Объем инокулята составлял 10%. Биомассу собирали центрифугированием при комнатной температуре на центрифуге T30 (Германия) при 4500 об/мин 15 мин и отмывали от культуральной среды двукратно 20 мМ натрий-фосфатным буфером рН 6.6. Осевшие клетки рассуспендировали в свежей порции буфера, распределяли по порциям и осаждали на центрифуге "Eppendorf" 3 мин при 12000 об/мин. Полученные осадки замораживали при -20 °С.
Дрожжевой штамм Pichia angusta ВКМ Y-2559 (далее P. angusta) был получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (Пущино). Клетки выращивали в жидкой среде при температуре 28 °С в кача-лочных колбах объемом 750 см3 с 100 см3 среды следующего состава (г/дм3): (NH4)2SO4 -2.5; MgSO4 • 7H2O - 0.4; K2HPO4 • 3H2O - 0.9; NaH2PO4 • 2H2O - 3.9 дрожжевой экстракт - 0.5; глицерин - 10, MnSO4 - 0.0012; CoCl2 • 6H2O -0.0003; (NH4)6Mo7O24 • 4H2O - 0.0002; CaCl2 • 2H2O - 0.0015; FeSO4 • 7H2O - 0.01; ЭДТА - 0.001. В колбы с двухсуточной жидкой культурой метилотрофных дрожжей добавляли микропипеткой по 1 см3 метанола к 100 см3 культуральной жидкости и снова ставили на качалку в тер
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.