научная статья по теме ПРИМЕНЕНИЕ НОВОГО МЕТОДА ОЧИСТКИ ДНК МИКРОБИОТЫ КАШТАНОВЫХ ПОЧВ ЗАПАДНО-КАЗАХСТАНСКОЙ ОБЛАСТИ ДЛЯ МЕТАГЕНОМНОГО АНАЛИЗА Сельское и лесное хозяйство

Текст научной статьи на тему «ПРИМЕНЕНИЕ НОВОГО МЕТОДА ОЧИСТКИ ДНК МИКРОБИОТЫ КАШТАНОВЫХ ПОЧВ ЗАПАДНО-КАЗАХСТАНСКОЙ ОБЛАСТИ ДЛЯ МЕТАГЕНОМНОГО АНАЛИЗА»

ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2015, № 4, с. 479-485

БИОЛОГИЯ ПОЧВ

УДК 641.4

ПРИМЕНЕНИЕ НОВОГО МЕТОДА ОЧИСТКИ ДНК МИКРОБИОТЫ КАШТАНОВЫХ ПОЧВ ЗАПАДНО-КАЗАХСТАНСКОЙ ОБЛАСТИ ДЛЯ МЕТАГЕНОМНОГО АНАЛИЗА*

© 2015 г. Н. Х. Сергалиев1, М. Г. Какишев1, А. Т. Жиенгалиев1, М. А. Володин1,

Е. Е. Андронов2, А. Г. Пинаев2

1 Западно-Казахстанский аграрно-технический университет им. Жангир хана, 090000, Республика Казахстан, Уральск, ул. Жангир хана, 51, 2Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии, 196608, Санкт-Петербург, ш. Подбельского, 3 е-шаП: kakishev_murat@mail.ru Поступила в редакцию 15.07.2014 г.

Проведена апробация методики выделения ДНК почвенной микробиоты на примере каштановых почв (Kastanozems) Западно-Казахстанской обл. Проведен таксономический анализ библиотек почвенного микробиома, согласно которому наибольшую долю в микробных сообществах проанализированных почв составляют филумы АйтоЬайепа и Рго1еоЬас1епа. Заметную долю в составе микробиомов исследованных образцов занимают археи. В темно-каштановой малоразвитой почве доля архей более 11%. Это интересный факт, так как обычно доля архей в почвенных сообществах целинных земель не превышает 5%. Кроме вышеуказанных типов, есть представители филумов ЛМоЬа^епа, Bacteroidetes, Firmicutes, Gemmatimonadales, Planctomycetes и УеггиеоткгоЫа, которые распространены в почвенных сообществах.

Ключевые слова: почвенные микроорганизмы, ПЦР, секвенирование, таксономия, каштановые почвы (Kastanozems), агроэкология, мониторинг, молекулярная биология, ^ рРНК, метагеном.

БО1: 10.7868/80032180X15040103

ВВЕДЕНИЕ

Традиционные методы анализа почвы дают приблизительные и неоднозначные результаты. Например, почвы с одними и теми же агрохимическими характеристиками могут кардинально различаться по плодородию. Факторы, которые ответственны за такие различия, как например, почвоутомление, часто трудно выявить. В настоящей работе для характеристики темно-каштанового типа почв выбран ее микробиом, главной составной частью которого, является геномный пул микроорганизмов — та частью почвы, которая наиболее чутка к любым изменениям. Связь особенностей микробиома почвы и ее плодородия почти не исследована. Для понимания этой связи требуется проведение комплексной работы.

В мировой микробиологии за последние 20 лет произошла настоящая революция в понимании истинных масштабов биологического разнообразия прокариот. Связано это во многом с бурным

* Работа выполнена в рамках подпрограммы 101 Грантовое финансирование научных исследований, приоритета: 5. Интеллектуальный потенциал страны, подприоритета: 5.1 Фундаментальные исследования в области естественных наук.

развитием и внедрением в экологическую практику методов молекулярной биологии. На сегодняшний день исследования в области молекулярной экологии микроорганизмов объединяются под общим названием метагеномные исследования. Объектом изучения метагеномики является метагеном — генетический материал, полученный непосредственно из окружающей среды без предварительного культивирования микроорганизмов. Одним из первых исследований в этой области является работа 1984 г., в которой авторами [10] на основе анализа полиморфизма гена 5S рРНК был сделан вывод о таксономическом составе симбиотического сообщества вестимен-тиферы Riftiapachyptila. В дальнейшем, с выходом работы Карла Воза "Бактериальная эволюция" ("Bacterial evolution", 1987), появилась фундаментальная идея о возможности классификации про-кариотных организмов на основе различий в генах их рибосомных РНК [25]. Это важное обобщение полностью определило направление для развития будущих исследований в этой области. Наряду с секвенированием генов 16S рРНК у уже известных видов микроорганизмов и уточнением их систематического положения, активно развивались

собственно метагеномные исследования. В результате появилось огромное количество информации, нуждающейся в систематизации, что повлекло за собой создание всемирных баз данных генетических последовательностей (таких как GenBank) и в частности гена 16S рРНК (Ribosom-al database project, RDPII). Создание централизованной системы хранения и анализа нуклеотид-ных последовательностей, в свою очередь, вывело исследования в молекулярной экологии на качественно новый уровень. Описанные выше открытия и научно-исследовательские работы позволяют изучить структуру микробного сообщества почвы. А поскольку она является чрезвычайно чуткой ко всем изменениям, включая структурные, физические, химические, агротехнические и т. д., то может быть своеобразным маркером. Анализ микробного сообщества почвы позволит понять ее особенности, которые дадут возможность использовать их в сельском хозяйстве [1—6, 13, 18, 22, 23].

Необходимость проведения исследований обусловлена насущными проблемами современного почвоведения, когда становится очевидным, что почва представляет собой живую субстанцию, способную к самовоспроизведению. Следовательно, анализ состояния почвенной микробио-ты должен стать неотъемлемой частью нового практически ориентированного почвоведения. Принимая во внимание, что подавляющая часть почвенной микробиоты является некультивируе-мой, очевидно, что единственной возможностью ее адекватного анализа являются методы современной метагеномики.

Об актуальности данного направления свидетельствует его активное развитие в зарубежной науке. Так, два высоко финансируемых европейских проекта, объединяющих исследовательские группы из разных стран (Terragenome, GenoSol), находятся в стадии интенсивной разработки [14—17].

Цель исследований — апробировать метод очистки ДНК микробиоты каштановых почв Западно-Казахстанской обл. для метагеномного анализа.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Для проведения молекулярно-биологических исследований микробиома почвенных образцов применяли типичную схему эксперимента. Которая заключалась в выделении и очистке совокупной ДНК из образца почвы, ПЦР-амплифи-кации определенных участков генома, их клонировании с последующим определением и анализом нуклеотидных последовательностей (секвенированием).

В процессе выделения ДНК из почвы использовали стандартное лабораторное оборудование

для работ по молекулярной микробиологии: автоматические дозаторы, центрифуги, оборудование для электрофореза, визуализации и документирования гелей, холодильники, морозильные камеры, вортексы и т. д.

Для разрушения образцов почв применяли прибор FastPrep-24 фирмы MP Biomedicals с адаптерами для 2 мл пробирок. В качестве мат-рикса для разрушения использовали смесь стеклянных шариков диаметром 0.1 и 0.5 мм (1 : 1 по весу) в количестве, равном весу образца почвы.

Для очистки препаратов ДНК использовали свежее перегнанный насыщенный буфер (0.1 M TRIS-HCl, pH 7.0, 0.2% меркаптоэтанол, 0.1% ок-сихинолин) фенола, приготовленный по обычной методике. В работе использовали смесь хлороформа (Molecular grade или "ч. д. а.") и изоамилового спирта (24 : 1 по объему).

Для выделения ДНК из агарозы использовали окись кремния производства фирмы SIGMA (Silicon dioxide, approx. 99%, кат. № S5631) без специальной обработки и натрий-фосфатный буфер. Для приготовления 1M буфера растворяли 8.19 г Na2HPO4 и 5.08 г NaH2PO4 в воде, после чего точно доводили pH до 7.0 раствором одной из солей (конечный объем 100 мл). Были приготовлены раствор А (натрий-фосфатный буфер 200 мМ + + гуанидина изотиоцианат 240 мМ, pH 7.0) и раствор Б (TRIS-HCl 500 мМ + SDS 1% (w/v), pH 7.0). Для проверки качества выделенной ДНК и при выделении ДНК из геля с оксидом кремния использовали обычную агарозу. Для очистки сырого экстракта ДНК использовали сорбцию на оксиде кремния. Для чего готовили следующие растворы: А — гуанидина тиоцианат (изотиоцианат) 3М + TRIS-HCl 20 mM + Triton X-100 20 мг/мл, pH 7.0) и Б — тонкодисперсную окись кремния, суспендированную в растворе А 40 мг/мл, В — этанол 25% (v/v) + изопропанол 25% (v/v) + NaCl 100 мМ + TRIS-HCl 10 мМ, pH 8.0), Г - TRIS-HCl 10 мМ + EDTA 1 мМ, pH 8.0.

В ходе исследования отобрали 16 образцов темно-каштановой почвы (табл. 1). Для выделения ДНК в пробирку объемом 2 мл с завинчивающейся крышкой брали навеску 0.2 г замороженной почвы. Добавляли приблизительно равное по объему количество матрикса (шариков), 350 мкл раствора А, 350 мкл раствора Б и 400 мкл смеси фенол-хлороформ. Пробирку помещали во встряхиватель и разрушали (FastPrep 24 - одну минуту при максимальной мощности). Затем центрифугировали при 10-15 х 103 g в течение 5 мин. Водную фазу аккуратно отбирали, добавляли 400 мкл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 1-3 мин, центрифугировали так же, как и на предыдущей стадии, аккуратно отбирали водную фазу.

Таблица 1. Место отбора почвенных проб в Западно-Казахстанской обл. и число нуклеотидных последовательностей ампликонных библиотек

Тип почв Место отбора GPS координаты Глубина отбора, см Краткое название fasta-файла Число нуклеотид-ных последовательностей

Солонец каштановый п. Актау N 50°56.869' 0- 10 SOLON_AKT_1 2267

(Solonetzes) Е 051°07.938' 10- -20 1560

Темно-каштановая п. Актау N 51°00.150' 0- 10 TKASHT_AKT_2 2745

неполноразвитая (НарИс Kastanozems) Е 050°09.025' 10- 20 1431

Темно-каштановая мало- п. Актау N 51°00.532' 0- 10 TKASHT_AKT_3 2585

развитая (НарИс Kastanozems) Е 051°18.278' 10- 20 1084

Лугово-каштановая п. Новопавловка N 51°08.774' 0- 10 LKASHT_NVPL_5 1717

(Fluvisols) Е 051°39.234' 10- 20 2435

Темно-каштановая средне- п. Новопавловка N 51°06.823' 0- 10 TKASHT_NVPL_6 3129

мощная (№рИс Kastanozems) Е 051°39.694' 10- 20 3549

Светло-каштановая п. Талдыапан N 49°33.450' 0- 10 SKASHT_TLD_7 2610

(№рИс Kastanozems) Е 050°16.249' 10- 20 2559

Каштановая п. Кушум N 50°52.599' 0- 10 KASHT_KUSH_8 1532

(ШрИс Kastanozems) Е 051°06.489' 10- 20 3348

Пойменная каштановая ЗКО г. Уральск N 51°07.731' 0- 10 POJM_URA 2003

(Fluvisols) пойма р. Урал Е 051°21.848' 10- 20 4378

Для обеспечения количественных вычислений точно измеряли объем экстракта, отобранного на последней стадии. Впоследствии эти данные использовали для пересчета.

К неочищенному экстракту ДНК добавляли один объем изопропилового

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком