НЕЙРОХИМИЯ, 2009, том 26, № 4, с. 282-289
== ОБЗОРЫ
УДК 612.8+577.25
ПРИМЕНЕНИЕ ВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ МОДЕЛИРОВАНИЯ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА
© 2009 г. М. Ю. Степаничев
Учреждение Российской академии наук Институт высшей нервной деятельности
и нейрофизиологии РАН, Москва
В обзоре рассмотрены современные методы моделирования болезни Альцгеймера у экспериментальных животных. Открытие связи метаболизма определенных белков с развитием нейродегенеративных процессов предоставило новые возможности для моделирования нейродегенеративных заболеваний. Развитие методов генной инженерии сделало возможным разработку моделей, основанных на направленной экспрессии таких белков в нейронах мозга лабораторных животных. В качестве средства доставки генов в таких моделях используются вирусные векторы. В работе обсуждаются особенности, преимущества и недостатки такого подхода.
Ключевые слова: болезнь Альцгеймера, вирусный вектор, мозг, нейрон, нейродегенерация.
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы исследования механизмов нейродегенеративных болезней привели к пониманию того, что развитие большинства патологий подобного рода связано с нарушениями метаболизма специфических белков. Многие из распространенных нейродегенеративных болезней, таких как болезнь Паркинсона и другие синуклеинопатии, болезнь Альцгеймера и другие амилоидозы, прионные, по-лиглутаминовые и другие болезни, характеризуются образованием в клетках или межклеточном пространстве отложений, образованных из патологически измененных белковых молекул. Нарушения синтеза, деградации и/или конформации определенных белков, по-видимому, инициируют патологические изменения в клетке, которые завершаются ее гибелью. Понимание этой закономерности привело к объединению ряда нейродегенеративных болезней в группу конформационных болезней [1]. Основные черты этих заболеваний - относительно поздний возраст манифестации, который обусловлен длительностью накопления в нейронах и/или паренхиме мозга патологически измененных белковых агрегатов, значительный удельный вес наследственных факторов в развитии нейродегенеративных болезней, а также во многом сходные молекулярные механизмы нарушения защиты клеток и их гибели. Другой не менее важной общей особенностью всех нейродегенеративных болезней является отсутствие эффективных методов их лечения.
Отсутствие современных эффективных методов терапии этой группы заболеваний в определенной степени связано с отсутствием моделей на животных, которые могли бы быть неоценимым
Адресат для корреспонденции: 117485, Москва, ул. Бутлерова, 5А; тел./факс: +7(495)9524007; e-mail: m_step@pochta.ru
средством поиска патогенетически обоснованных подходов к их лечению. Хорошо известные инъекционные модели нейродегенеративных болезней, основанные на использовании различных нейро-токсинов, позволяют воспроизводить отдельные симптомы клинической картины заболеваний [2]. Несмотря на относительную простоту технических манипуляций, необходимых для реализации этих моделей, и их низкую себестоимость эти модели имеют ряд слабых сторон. Так, нейротоксины обладают неспецифической токсичностью, что проявляется в гибели клеток независимо от их фенотипа и/или медиаторной специфичности.
Открытие того, что дисфункция и/или дегенерация нейронов могут быть результатом мутации одного клеточного белка, предоставляет новые возможности для моделирования патологических процессов, лежащих в основе нейродегенеративных болезней. Один из традиционных подходов, который давно и с разной степенью успешности используется в этой области, заключается в получении му-тантных трансгенных животных. Последние успехи в получении рекомбинантных вирусов предоставляют возможность разработки альтернативного способа получения трансгенных животных путем непосредственного введения таких вирусных конструкций, содержащих мутантные гены интересующих исследователей белков, в мозг взрослых животных. В этом обзоре мы рассмотрим возможности использования такой технологии для моделирования одной из наиболее распространенных нейродегенеративных болезней - болезни Альцгеймера (БА).
Около 15 млн. чел. по всему миру страдают сегодня от БА [3]. Проведенные в НЦПЗ РАМН эпидемиологические исследования показали, что 4.5% (более 70 тыс. чел.) московского населения в воз-
расте 60 и старше лет страдают деменцией альцгей-меровского типа, причем у 1.8% обследованных выявлены выраженные и тяжелые формы БА [4]. По прогнозам, к 2050 г. ожидается, что число больных БА утроится [5].
ПАТОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА
БА представляет собой заболевание, возникающее в предстарческом возрасте (обычно 50-55 лет), в основе которого лежит прогредиентный атрофи-ческий процесс в головном мозге, завершающийся тотальным афато-апракто-агностическим слабоумием [6]. В основе когнитивных нарушений, наблюдающихся при БА, лежат нейродегенератив-ные изменения в мозге пациентов, которые начинаются в трансэнторинальной области и постепенно распространяются на примыкающие корковые и подкорковые участки лимбической системы [7]. На более поздних этапах развития патологии нейроде-генерация наблюдается и в ассоциативных областях коры больших полушарий.
Основными гистопатологическими признаками БА являются накопление экстраклеточных се-нильных бляшек и внутриклеточных нейрофиб-риллярных клубков [7, 8]. Как правило, бляшки образуются в мозге задолго до появления клинических симптомов БА. Основным белковым компонентом сенильных бляшек является амилоидный Р-пептид (АР) [9]. АР образуется в результате расщепления большого трансмембранного белка предшественника амилоида (БПА) двумя протеазами, получившими название Р- и у-секретаз. Расщепление, катализируемое у-секретазой, ведет к образованию двух форм АР, состоящих из 40 или 42 аминокислот (АР(1-40) или АР(1-42) соответственно) [8]. АР(1-42) быстрее образует преципитаты в виде фибрилл по сравнению с АР(1-40), и его содержание в ткани мозга пациентов выше по отношению к Ар(1-40) [10].
Нейрофибриллярные клубки представляют собой пучки парных спиральных филаментов гипер-фосфорилированного белка тау. Появление нейро-фибрилл свидетельствует о разрушении микротрубочек и нейрофиламентов и, следовательно, о повреждении нейронов и гибели клеток [11]. При выраженной БА внутриклеточные нейрофибриллярные клубки наблюдаются в III и V слоях ассоциативной коры, базальных ядрах переднего мозга и различных ядрах ствола. Гиперфосфорилирование тау считается одним из наиболее ранних признаков нейродегенерации и предшествует образованию фибриллярных клубков или сенильных бляшек [7]. Сайт-специфичное фосфорилирование тау - результат деятельности множества протеинкиназ и фосфатаз, что, по-видимому, отражает нарушение баланса процессов фосфорилирования и де-
фосфорилирования при таупатиях, в том числе и при БА [12].
СЕМЕЙНЫЕ ФОРМЫ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА
Несмотря на то, что большинство случаев заболевания БА являются спорадическими, было выявлено несколько генных мутаций, которые ведут к раннему проявлению симптомов БА. Мутации трех генов, кодирующих БПА и пресенилины 1 и 2, могут вызывать БА в некоторых семьях. Мутации гена БПА ведут к замещению одних аминокислот на другие вблизи мест расщепления Р- и у-секретазами [13—15]. Это способствует сдвигу процессинга БПА в сторону образования Ар. Мутации генов пресени-линов 1 и 2, которые являются интегральными частями у-секретазного комплекса, приводят к усилению продукции АР(1—42) [16].
Мутация гена, кодирующего белок тау, также ведет к нейродегенеративным изменениям в результате накопления в клетках нерастворимых агрегатов тау. Характер нейродегенерации при этом отличается от БА. Результатом ее является развитие наследуемой формы лобно-височной деменции с паркинсонизмом [17, 18].
СОВРЕМЕННЫЕ ВЕКТОРНЫЕ КОНСТРУКЦИИ КАК СРЕДСТВО МОДЕЛИРОВАНИЯ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Открытие генных мутаций, связанных с наследуемыми формами БА, позволило начать разработку моделей, основанных на переносе генетического материала. Концептуальной основой для создания таких моделей стала амилоидная гипотеза патогенеза БА. Согласно этой гипотезе, центральным событием БА является повышенная продукция АР и образование амилоидных депозитов в мозге. Поэтому исследование метаболизма нормальных и му-тантных БПА и пресенилинов стало основным фокусом исследований в этой области. Изучение метаболизма этих белков возможно проводить в культурах клеток, для которых существуют хорошо отработанные методы переноса генетического материала. Однако главным элементом любых биохимических или физиологических исследований является создание модели на животных.
Существует большой набор методов трансфера генетического материала в геном животного. Трансфекция может быть проведена с помощью физико-химических методов, таких как кальций-фосфатный метод [19], липофекция [20], электро-порация [21] и т.д. Более подробно разнообразные методы трансфекции рассмотрены в обзоре [22]. Большинство этих методов малоэффективно и требует больших затрат труда. Кроме того, трансфекция с помощью этих методов возможна только на
нескольких типах клеток и весьма затруднена на нейронах. Поэтому для трансфера генов все большее применение находят методы, основанные на использовании вирусных векторов. Доставка генов с помощью вирусных векторов высокоэффективна, а основным ограничением для их использования до недавнего времени являлась довольно высокая ци-тотоксичность. Совершенствование методов клонирования позволило заметно снизить токсичность векторов без существенного снижения эффективности трансфекции. В настоящее время для прижизненной трансфекции нейронов используют векторы, разработанные на основе аденовирусов (Ad), рекомбинантных адено-ассоциированных вирусов (rAAV) или лентивирусов (rLV) [22-26].
Ad векторы создаются на основе вирусов, принадлежащих к группе ДНК-вирусов. Они способны проникать в делящиеся и неделящиеся клетки, но их генетический материал не может интегрироваться в геном клетки-хозяина. Существенным недостатком Ad векторов является их взаимодействие с клетками иммунной системы, сопровождающееся мощным воспалительным о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.