ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2014, том 455, № 6, с. 727-730
^ ОБЩАЯ
БИОЛОГИЯ
УДК 575.17:597.553.2
ПРИМЕНИМОСТЬ SCAR-МАРКЕРОВ ДНК ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ КАМЧАТСКОЙ МИКИЖИ (PARASALMO (ONCORHYNCHUS) MYKISS) © 2014 г. М. Н. Мельникова, С. Д. Павлов, М. В. Шитова
Представлено академиком Ю.Ю. Дгебуадзе 19.11.2013 г. Поступило 19.11.2013 г.
БО1: 10.7868/$086956521412024Х
Вид Parasalmo (Oncorhynchus) mykiss (камчатская микижа; микижа) относится к лососевым рыбам (сем. SALMONIDAE), отличается сложной популяционной структурой, широким распространением и высоким темпом микроэволюции. Это одна из причин длительного и разностороннего изучения микижи многими учеными. Дикая проходная форма этого вида была занесена в Красную книгу, а жилая форма является широко распространенным объектом аквакультуры.
Популяции, обитающие на камчатской части ареала Parasalmo (O.) mykiss, являются наименее изученными в силу малодоступности мест их обитания. При этом низкая антропогенная нагрузка на экосистемы Камчатки позволяет работать здесь с природным генофондом вида, что делает такие исследования особенно ценными. Генетические особенности камчатской группы микижи стали исследовать сравнительно недавно, работы на популяционно-генетическом уровне все еще немногочисленны. Некоторые из них указывают на малоэффективность для камчатских популяций генетических маркёров и методов исследования, которые были применены американскими исследователями при изучении филогенетических отношений североамериканской микижи [1—4]. Согласно предыдущим исследованиям, камчатская группа оказалась монофилетичной и мало дифференцированной [5, 6]. Встал вопрос об отборе высокоспецифичных маркеров именно для камчатских популяций Parasalmo (O.) mykiss. Нашим коллективом были подобраны 7 SCAR-маркеров (Sequence Characterized Amplified Region — "охарактеризованный секвенированием ампли-фицированный район"), описанные нами в предыдущей работе [7]. В данном исследовании оценивается применимость подобранных марке-
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской Академии наук, Москва
ров и метода в целом для характеристики отношений микижи Parasalmo (O.) mykiss из камчатского и других частей видового ареала.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Всего в проведенной работе были использованы выборки из восьми популяций, обитающих в наиболее крупных реках и водных бассейнах Камчатки. Четыре популяции представляли западное побережье Камчатки (реки Тигиль, Се-данка, Утхолок, Сопочная); четыре — восточное побережье (реки Жупанова, Быстрая, Двухюрточ-ная, Еловка). В качестве географической аутгруп-пы использовали выборки из североамериканских и чилийских популяций Parasalmo (O.) mykiss, в качестве репера — близкородственный вид — камчатскую симу (Oncorhynchus masou).
Вид камчатская микижа на Камчатке имеет сложную популяционную структуру и представлен разными экоформами [8]. Учитывая, что в большинстве случаев выборки собирались от половозрелых рыб, для более полной характеристики генома в анализ были включены объединенные выборки, взятые ото всех экоформ из каждой сложной популяции. Выборки североамериканской микижи содержали прибрежную (coastal) и материковую (рыборазводную, inland) формы. Чилийская микижа была представлена рыбораз-водной и эстуарной формами. Популяции, исследованные в данной работе, приведены в табл. 1.
Тотальную ДНК выделяли из замороженной мышечной ткани стандартным методом, включающим гомогенизацию материала с буфером Net 25 (100 мМ NaCl, 20 мМ Tris-HC, pH 7.5-8.0, 25 мМ ЭДТА), лизис клеток 3%-м саркозилом натрия, инкубацию лизата с протеиназой К (100 мкг/мл) в течение 3 ч при 60°C и депротеинизацию смесью фенол-хлороформ (1 : 1) и хлороформ-изоамило-вый спирт (24 : 1).
Тест на количество и качество ДНК, подбор SCAR-праймеров, праймеры и условия ПЦР по-
Таблица 1. Исследованные образцы ДНК P. (O.) mykiss и O. masou
№ Локальность Вид Форма Количество образцов
1 Река Сопочная, западное побережье Камчатки Parasalmo (O.) mykiss Объединенная выборка 25
2 Река Утхолок, западное побережье Камчатки Parasalmo (O.) mykiss Объединенная выборка 53
3 Река Двухюрточная, восточное побережье Камчатки Parasalmo (O.) mykiss Резидентная 15
4 Река Еловка, восточное побережье Камчатки Parasalmo (O.) mykiss Резидентная 6
5 Река Тигиль, западное побережье Камчатки Parasalmo (O.) mykiss Резидентная 11
6 Река Седанка, западное побережье Камчатки Parasalmo (O.) mykiss Резидентная 33
7 Река Быстрая, восточное побережье Камчатки Parasalmo (O.) mykiss Резидентная 10
8 Чили, Hatchery Parasalmo (O.) mykiss Рыборазводная 13
9 Чили, Canalal River Parasalmo (O.) mykiss Эстуарная 13
10 Чили, Gala River Parasalmo (O.) mykiss Эстуарная 10
11 Река Коль, западное побережье Камчатки Oncorhynchus masou Проходная 15
12 Северная Америка, Quinault River Parasalmo (O.) mykiss Линия coastal 5
13 Северная Америка, Chilliwaсk River Parasalmo (O.) mykiss Линия coastal 5
14 Северная Америка, Dworshak Hatchery Parasalmo (O.) mykiss Линия inland 5
15 Северная Америка, Crystal Lake Hatchery Parasalmo (O.) mykiss Линия inland 5
16 Северная Америка, Sacramento River Parasalmo (O.) mykiss Линия coastal 5
17 Река Жупанова, восточное побережье Камчатки Parasalmo (O.) mykiss Резидентная 27
дробно описаны нами в предыдущей работе [7]. Всего было проанализировано 7 8СЛЯ-маркеров.
Оценку частот нуль-аллелей рассчитывали по формуле Л.А. Животовского для диплоидных объектов, исследованных мультилокусными доминантными ДНК-маркерами [9]. Статистическую ошибку, дисперсию и критерий Стьюдента рассчитывали следуя обычным рекомендациям [10]. Аллельное разнообразие оценивали согласно руководству Вейра [11]. Степень дифференциации популяций (9^, аналог [11]) оценивали с использованием программы GDA [12]. На основе матрицы коэффициентов попарного сходства определяли координаты каждой выборки в пространстве главных компонент изменчивости по программе 81аЙ8Йеа 10.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Мы рассчитали аллельное разнообразие для диаллельных локусов. Полученные величины находились в пределах от 0.255 (микижа из реки Жу-панова) до 0.373 (микижа из реки Еловка), что свидетельствует о достаточной информативности используемых 8СЛЯ-маркёров.
Попарное сравнение значений аллельного разнообразия (Не) с использованием критерия Стьюдента выявило достоверные отличия показателя Не симы (р < 0.05) от таковых всех выборок микижы. Так же достоверные отличия наблюдались по показателю разнообразия микижи из ре-
ки Седанка (р < 0.038, 0.043, 0.008) по сравнению с выборками из рек Сопочная, Утхолок и Жупа-нова соответственно. Уровень генетического разнообразия в этих трех популяциях относительно низкий.
Величина межпопуляционной дифференциации, измеряемая показателем 9^ (аналог [11]), определяет долю межпопуляционной изменчивости в общей изменчивости. В среднем по всем ло-кусам она принимала значение 26.9%, выступая статистически значимой величиной, что указывает на значительную дифференциацию популяций микижи по изученным локусам (табл. 2, рис. 1).
Общие значения 9^, рассчитанные для микижи из всех исследованных регионов, лежат в диапазоне от 0.1 до 24%. По сравнению с североамериканскими популяциями наибольший процент различий отмечается между популяциями мики-жи на западном и восточном побережьях Камчатки (22.4 и 24% соответственно). Существенные различия между западным и восточным регионами Камчатки (13%) подтверждают, что маркёры для географического разделения камчатских популяций были выбраны верно. Меньшие, но также высокие значения 9^ отличали камчатские популяции микижи от чилийских популяций (21.6% для восточных и 14.6% для западных). Наименьший процент различия (0.8%) выявлен между чилийскими и североамериканскими популяциями.
ПРИМЕНИМОСТЬ ЗСЛЯ-МАРКЕРОВ ДНК 729
Таблица 2. Оценки внутри- и межрегиональной дифференциации популяций микижи (% единиц 9)
Сима Восточное побережье Камчатки Западное побережье Камчатки Америка Чили
Регион Внутрирегиональная дифференциация
19.6% 0.1% 4% 12.2%
Межрегиональная дифференциация
Восточное побережье Камчатки 40% —
Западное побережье Камчатки 17% 13% —
Америка 25% 24% 22.4% —
Чили 43% 21.6% 14.6% 0.8% —
Примечание. Для каждой пары сравниваемых регионов, представленных несколькими выборками, были оценены все попарные значения 9 [11] и затем усреднены, давая среднюю оценку 9 между этими регионами.
При определении уровня внутрирегиональной дифференциации популяций микижи выяснилось, что он низок у западнокамчатских и североамериканских популяций (0.1 и 4% соответственно) и достаточно высок у восточно-камчатских и чилийских популяций (19.6 и 12.2% соответственно). Это говорит о том, что выбранные маркёры не только демонстрируют географическую подразделенность наших выборок, но и способны выявить различия прак-
тически в каждой популяции микижи по отдельно взятой реке.
Все изложенное представлено на графике в пространстве главных компонент (рис. 1а по первой и второй компоненте), построенном по матрице значений между всеми парами выборок [11], где демонстрируется географическое подразделение восточных и западнокамчатских популяций микижи. Исключением является популяция из восточнокамчатской р. Двухюрточная,
11
ГК 2: 42.19% 6
5
4
3 2 1 0 -1 -2 -3 -4 -5 -6
(а)
0 Active
о Западная Камчатка ж Восточная Камчатка ЛЧили
■ Северная Америка • Сима
-7 -14
12-16
17 Ж
3
«
▲
Л 9 10
А
8
7
5 *
ОО 4
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4
-1 -2 -3
6
о Active • Сима
о Западная Камчатка ж Восточная Камчатка а Чили
■ Северная Америка
ГК 3: 6.69% 6
5
4
3 2 1
0
1-2 <Х>
ж>5
6
Ж4
▲
8
(б)
9
Д 12-16|
▲
10
11
ГК 1: 48.79%
-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6
ГК 2: 42.19%
7
6
3
2
Рис. 1. Генетическая дифференциация микижи (в качестве репера использован близкородственный вид сима (Oncorhynchus masou) в пространстве главных компонент по программе Statistica 10 (а — по первой и второй компонентам, б — по второй и третьей компонентам). Нумерация популяций, как в табл. 1. Генетические координаты (главные
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.