научная статья по теме ПРИОБРЕТЕНИЕ РАДИОИНДУЦИРОВАННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К γ-ОБЛУЧЕНИЮ СОПРОВОЖДАЕТСЯ У КЛЕТОК ПОВЫШЕНИЕМ ИХ Н2О2-КАТАБОЛИЗИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ Науковедение

Текст научной статьи на тему «ПРИОБРЕТЕНИЕ РАДИОИНДУЦИРОВАННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К γ-ОБЛУЧЕНИЮ СОПРОВОЖДАЕТСЯ У КЛЕТОК ПОВЫШЕНИЕМ ИХ Н2О2-КАТАБОЛИЗИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ»

Биологические науки Радиобиология

Тырсина Е.Г., доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Календо Г.С\ доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник (Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина Российской академии медицинских наук) Эйдельман Ю.А., кандидат биологических наук, научный сотрудник Института биохимической физики им. Н.М. Эммануэля Российской академии наук

ПРИОБРЕТЕНИЕ РАДИОИНДУЦИРОВАННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К у -ОБЛУЧЕНИЮ СОПРОВОЖДАЕТСЯ У КЛЕТОК ПОВЫШЕНИЕМ ИХ Н2О2-КАТАБОЛИЗИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ

Одной из кардинальных проблем радиационной онкологии является преодоление устойчивости опухолей к облучению. Нередко в ходе, казалось бы, успешного лечения новообразование теряет свою первоначальную чувствительность к радиации и становится более радиоустойчивым (10). Повышенную радиорезистентность (РР) могут проявлять и опухолевые рецидивы, возникающие после полного курса лучевой терапии (7), что является одним из основных факторов, снижающих эффективность такого лечения. Для решения этой проблемы необходимо выяснение механизмов, лежащих в основе приобретенной РР. К сожалению, этот важный для онкологии радиобиологический феномен остается слабоизученным. Информация о причинах возникновения РР опухолевых клеток после лучевой терапии крайне скудна, а сами исследования в этом направлении носили больше феноменологический характер. Среди причин недостаточной изученности данного явления основными являются две: сложность и многофакторность механизмов, определяющих развитие устойчивости опухолевой популяции к облучению, и отсутствие радиобиологических моделей. Поэтому с целью изучения феномена приобретенной РР нами была разработана адекватная и стабильная клеточная система, состоящая из исходной линии злокачественных фибробластов ДХ-ТК- и линии их радиорезистентных потомков ПОК-20, выживших после у-облучения исходных клеток в дозе 20 Гр (9). Известно, что одним из основных механизмов поражающего действия у-излучения является образование активных форм кислорода, которые возникают в результате радиолиза воды (3) и вызывают труднорепарируемые повреждения ДНК и других клеточных структур, причем в гораздо большей степени, чем само излучение. Вещества, защищающие клетки от действия активных форм кислорода, или антиоксиданты, имеют различную природу, а из механизмов их действия можно выделить два основных: перехват свободных радикалов и разложение гидроперекисей и перекисей (1, 8). Поэтому устойчивость клеток к радиации и другим генотоксичным агентам часто связана с активным катаболизмом клетками перекиси водорода; причем, в работах (2, 6) показано, что Н2О2-катаболизирующая активность прямо коррелирует с общей антиоксидантной активностью. В связи с изложенным выше, целью настоящего исследования явилась проверка предположения о том, что приобретение РР клетками линии ПОК-20 связано с повышением их антиоксидантной активности. Для это-

го провели сравнительное изучение Н2О2-катаболизирующей активности фибробластов джунгарского хомячка линии ДХ-ТК- и её радиорезистентного варианта ПОК-20 в норме и после у-облучения. Использование в работе клеток изогенных линий позволяло объективно сравнивать исследуемые признаки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Исследования проводили на клеточной системе, состоящей из родительской линии злокачественных фибробластов джунгарского хомячка ДХ-ТК-, трансформированных вирусом БУ-40, и радиорезистентной линии потомков этих клеток, переживших однократное у-облучение в дозе 20 Гр - линии ПОК-20. Клетки выращивали согласно методике (9). Для исследования влияния у-облучения на внутриклеточную антиокси-дантную активность прикрепленные к подложке клетки однократно облучали на установке «Агат-Р» с источником излучения 60Со, мощностью 0,55 Гр/мин, на расстоянии 0.7 м от источника. Внутриклеточную Н2О2-катаболизирующую активность определяли по скорости разложения Н2О2 лизатом исследуемых клеток. Для лизиса к клеточной суспензии добавляли Тритон Х-100, инкубировали 25 мин при 0°С, центрифугировали 10 мин при 2900 об/мин при 0°С и супернатант использовали для спектрофотометрии, которую проводили по методу (5). Мерой количества лизата служила масса белка, концентрацию которого определяли по Брэдфорду (4, 6). Далее к лизату клеток добавляли Н2О2 и по изменению оптической плотности реакционной смеси при ^=240 нм (максимум спектра поглощения Н2О2) определяли характерное время ее распада т (5). При постоянном количестве лизата снималась зависимость т от начальной концентрации Н2О2, а высота плато на этой зависимости определяла Н2О2-катаболизирующую активность. Уровень катаболизма перекиси оценивали как в ин-тактных, так и облученных в дозе 12,5 Гр клетках, через 1 ч, 6 ч и 24 ч после радиационного воздействия. Лизат разводили до концентрации белка 2 мг/мл. Рабочая кювета содержала ли-зат и перекись; контрольная - только лизат в той же концентрации. Для работы использовался 0,12% (35 мМ) раствор Н2О2. Предварительно, на этапе оптимизации параметров, были определены концентрации лизата - 0.6 мг/мл и Н2О2 - 0.024%, при которых кривые распада Н2О2 хорошо описываются экспоненциальной зависимостью, хотя при изучении разных ли-затов был покрыт весь рассмотренный диапазон концентраций Н2О2 (0,012-0,06%). Проведено 4 независимых эксперимента по снятию зависимостей скорости разложения Н2О2 от её начальной концентрации лизатами клеток обеих линий в норме и после у-облучения. Из этих кривых определяли значения т, которые отражают внутриклеточную Н2О2-катаболизирующую активность.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. На рисунке 1 приведены зависимости характерного времени разложения перекиси (т) лизатами интактных клеток от её начальной концентрации (чем меньше т, тем катаболизм Н2О2 выше). Видно, что для П0К-20 зависимость выражена очень слабо, что, по-видимому, связано с высоким содержанием в этих клетках веществ, реагирующих с Н2О2. Для родительских клеток линии ДХ-ТК- зависимость т от концентрации Н2О2 выходит на плато при существенно меньших концентрациях перекиси. Плато для родительских клеток расположено не только левее, но примерно и в 1,4 раза выше, чем для П0К-20. Это означает, что интактные радиорезистентные клетки-потомки обладают большей способностью к разложению Н2О2, чем их чувствительные клетки-предшественники ДХ-ТК-. Подобный ход кривых может отражать, во-первых, различную концентрацию разлагающих перекись водорода веществ; во-вторых, то, что в резистентных клетках ПОК-20 эти вещества активнее, чем в родительских (например, более подходящие условия для работы каталазы и других ферментов); и в третьих, свидетельствовать о наличии в клетках-потомках соединений, отсутствующих в родительских и также

ем

О

ем

X

180

160

140

X

ф

X о с

м га

р20 К

Ф

^ 100 Ш

80

60

0.012

0.030 0.036 [Н202], %

0.042 0.048 0.054 0.060

Рис. 1. Время (сек) разложения Н2О2родительскими клетками ДХ-ТК и их радиорезистентными потомками ПОК-20 в отсутствие облучения

обладающих Н2О2-катаболизирующей активностью. На рисунках 2 (А, Б) приведены зависимости характерного времени (т) разложения перекиси от её начальной концентрации лизата-ми клеток обеих линий через 1 ч, 6 ч и 24 часа после их облучения в дозе 12,5 Гр. На рис. 2 А видно, что под действием излучения величина т заметно возрастает, т.е. скорость разложения Н2О2 родительскими клетками ДХ-ТК- уменьшается. Максимальное её падение наблюдается через 1 ч после лучевого воздействия, после чего постепенно восстанавливается, однако через сутки ещё не достигает контрольного уровня. По-видимому, сразу после облучения разлагающие перекись ферменты этих клеток расходуются, а затем постепенно восстанавливаются, причем для полного их восстановления требуется интервал времени, превышающий 24 часа. В отличие от клеток ДХ-ТК-, зависимости т от начальной концентрации перекиси для радиорезистентных клеток ПОК-20 при всех временных интервалах похожи друг на друга и на зависимость, снятую для интактных клеток (рис. 2Б). Данные, полученные в опытах с облучением, свидетельствуют о том, что радиационное воздействие ещё более, чем в контроле, увеличивает разрыв в Н2О2-катаболизирующей активности между потомками и родительскими клетками: если в норме катаболизм перекиси резистентными клетками ПОК-20 превышал таковой родительских ДХ-ТК- в 1,4 раза, то через 1 час после облучения - уже в 3,5 раза. Анализируя эти результаты, можно сделать два альтернативных предположения: или уровень катаболизма перекиси в клетках линии ПОК-20 под действием облучения не меняется, что подтверждает сходный вид кривых; или в результате облучения Н2О2-катаболизирующие системы ПОК-20 подобно таковым родительских клеток расходуются, однако их восстановление в последующее время протекает более эффективно. Об этом свидетельствует тот факт, что для обеих линий максимальная высота плато после облучения зарегистрирована через 1 ч. Вместе с тем, незначительность увеличения высоты плато для ПОК-20 говорит о том, что или доля израсходовавшихся антиоксидантов у потомков гораздо меньше, чем у ДХ-ТК-, или же большая часть их успела восстановиться в течение первого часа, что представляется нам более вероятным. В любом случае, наличие более длинного и одновременно высокого плато у клеток ПОК-20 как до, так и после облучения по сравнению с родительскими клетками свидетельствует о более эффективной и устойчивой к облучению Н2О2-катаболизирующей активности этих клеток. Таким образом, выявлена прямая корреляция между повышенной устойчивостью клеток к радиации и эффективностью катаболизма

перекиси водорода. При этом исходно повышенный по отношению к ДХ-ТК- уровень Н2О2-катаболизирующей активности у радиорезистентных клеток ПОК-20, в отличие от родительских, не подавлялся интенсивным у-облучением. Поэтому вполне вероятно, что активные и устойчивые к облучению внутриклеточные системы, разлагающие Н2О2 в клетках ПОК-20, могут являться ответственными за их высокую РР.

О

о

Л

О

400 350 300 250

Ф *

2 200 5Таи, с М (О

Л 150

Ф СР СО

100 50

400

о

о

350

Л

О

300

К

X 250

О

£

о 200

Хаи , с

ц п

(0 150

р

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком