ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 2, с. 184-192
УДК 579.8.017.7
ПРОДУКЦИЯ ГИДРОЛАЗ И АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ МОЛОЧНОКИСЛЫХ И БИФИДОБАКТЕРИЙ
© 2007 г. Г. И. Новик, Н. И. Астапович, Н. Е. Рябая
Институт микробиологии НАН Беларуси, 220141, г. Минск; e-mail: collection@mbio.bas-net.bu Потупила в редакцию 14.03.2005 г.
Показано, что бифидо- и молочнокислые бактерии Bifidobacterium adolescentis и Lactobacillus sp. синтезируют внеклеточные ферменты, расщепляющие гликозидные связи в молекулах декстрана, пектовой кислоты и растворимого крахмала. Максимальное образование внеклеточной Р-галакто-зидазы у B. adolescentis 91-БИМ и 94-БИМ наблюдалось в экспоненциальной фазе роста на 5 и 12 ч культивирования со скоростью 0.08 и 0.03 ед./мгч соответственно. Культуры бифидобактерий при хранении свыше 6 мес. сохраняли 60-70% активности Р-галактозидазы и а-амилазы. Исследованные штаммы бифидобактерий были устойчивы к амфотерицину и аминогликозидам: гентамицину, кана-мицину, нетромицину. Лактамные антибиотики пенициллинового ряда - ампициллин, бензилпени-циллин, бициллин-3, бициллин-5, карбенициллин, препараты, подавляющие синтез белка на уровне рибосом (линкомицин), ингибиторы РНК-полимеразы (рифампицин), а также цефалоспорин максипим ингибировали рост бифидобактерий. На рост Lactobacillus sp. не оказывали влияния рифампицин, эритромицин, амфотерицин, максипим, фортум, доксициклин, левомицетин, стрептомицин, аминоглико-зиды - нетромицин, гентамицин и канамицин; подавляли рост полусинтетические производные пенициллина - карбенициллин и ампициллин, а также оксамп и линкомицин. Лактамные антибиотики -бензилпенициллин, бициллин-3 и бициллин-5 ингибировали рост лактобацилл на 30-90%.
Бифидо- и молочнокислые бактерии являются естественными обитателями желудочно-кишечного тракта человека и животных. На их основе созданы лечебно-профилактические препараты, способствующие формированию и функционированию микробиоценоза организма, эффективные при острых и хронических кишечных инфекциях, аллергических, иммунодефицитных и других состояниях [1, 2]. Молочнокислые бифидобактерии обладают морфокинетическим действием, продуцируют биологически активные соединения - витамины группы В, полисахариды, гликопротеины, ферменты, участвуют в метаболизме белков, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот, детоксика-ции экзо- и эндогенных токсичных соединений, выполняют иммуногенную и антимутагенную функции [3-5].
Перспективным является создание принципиально новых лечебно-профилактических препаратов и биологически активных добавок на основе живых, физиологически активных клеток бифидо- и молочнокислых бактерий, а также продуктов дезинтеграции клеток, биологически активных экзометаболитов - внеклеточных гидролаз, летучих жирных кислот, молочной кислоты, клеточных полимеров - полисахаридов, гликопротеи-нов, компонентов клеточной стенки и др. [6-12].
В литературе недостаточное внимание уделяется вопросам продукции молочнокислыми и би-фидобактериями гидролитических ферментов,
принимающих непосредственное участие в метаболизме питательных веществ. Функции гидролаз в обмене веществ - это катализ не только реакций гидролиза олиго- и полисахаридов, но и реакций синтеза гликопротеинов и гликолипидов. [6-8]. Одним из требований при разработке технологий производства биопрепаратов нового поколения на основе молочнокислых и бифидобактерий является подбор штаммов, обладающих высоким уровнем активности гидролитических ферментов, необходимых для гидролиза ^-связей в молекулах полисахаридов, а также фрукто- и га-лактоолигосахаридов, устойчивых к действию пищеварительных и панкреатических ферментов. Важным является участие продуктов реакций в формировании иммунологического ответа макроорганизма, обеспечении высокой степени колонизации слизистых симбионтной микрофлорой, стимуляции пролиферации молочнокислых и бифидобактерий в пищеварительном тракте [13].
Современные схемы лечения заболеваний предусматривают применение пробиотических препаратов на фоне сильнодействующих антибиотиков нового поколения. Поэтому штаммы, входящие в состав препаратов, должны отличаться устойчивостью к антибиотикам широкого спектра действия. Известно, что при введении антибиотиков в среду культивирования в клетках индуцируется серия ответов, позволяющих им выжить в неблагоприятных условиях. Среди этих ответов -
синтез и секреция гидролитических ферментов, появление клонов клеток, устойчивых к данному препарату, способных к пролиферации и восстановлению численности популяции. Исследование феномена антибиотикорезистентности развивающихся популяций молочнокислых и бифидобак-терий и составление детальных антибиотико-грамм штаммов микроорганизмов-пробиотиков необходимо для разработки технологических схем производства препаратов и их применения в комплексной терапии инфекций желудочно-кишечного тракта.
Цель работы - исследование физиолого-био-химических особенностей молочнокислых и би-фидобактерий: оценка спектра и уровня продукции гидролитических ферментов, изменения активности ферментов при хранении штаммов, а также их способности к росту в присутствии антибиотиков с различной молекулярной структурой.
МЕТОДИКА
Объектами исследований служили штаммы бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum № 1, B. bifidum ЛВА-3, B. bifidum 791, B. adolescentis ГО-13, B. adolescentis MC-42, B. longum B379M, любезно предоставленные сотрудниками ВНИИ молочного института (Москва) и Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского. Штаммы B. adolescentis 91-БИМ и B. adolescentis 94-БИМ получены в лаборатории биохимии микроорганизмов, депонированы как B. adolescentis БИМ В-91 и B. adolescentis БИМ В-87 в научной Коллекции типовых и промышленно-ценных непатогенных микроорганизмов Института микробиологии НАНБ (Белорусская коллекция непатогенных микроорганизмов).
Бактерии Lactobacillus sp. выделены из коммерческого препарата "Лактобактерин сухой" (Lactobacterinum siccum) производства НПО "Им-мунопрепарат" (г. Уфа, Россия).
Культуры выращивали в микроаэрофильных условиях при 37°C на кукурузно-лактозной среде (КЛС), модифицированной КЛС с гидролизатом казеина и дрожжевым экстрактом (КЛД), среде с пептоном [14], бульоне МРС [2]. В качестве посевного материала использовали культуры молочнокислых и бифидобактерий III генерации. Время культивирования 24-120 ч в зависимости от целей эксперимента.
Морфологию бифидобактерий изучали с помощью фазово-контрастной микроскопии (МБИ-16, Россия). Препараты для световой микроскопии готовили по стандартным методикам, окрашивали по Граму в модификации Хукера или метилено-вой синью по Леффлеру. Цитологические методы исследований препаратов для растровой (РЭМ) и трансмиссионной (ТЭМ) электронной
микроскопии описаны нами в предыдущих публикациях [5].
Для изучения динамики накопления биомассы и продукции гидролаз 2.5-5.0% (об.) 18-часовых культур бактерий вносили в питательную среду и инкубировали в термостате при 37°C. Пробы отбирали через каждые 3, 6, 24 ч в течение 3-5 сут. Биомассу определяли весовым методом, высушивая отмытые клетки до постоянного веса при 105°С, а также по оптической плотности суспензии бактерий при 590 нм. Количество жизнеспособных клеток бактерий в 1 мл суспензии (число колониеобразующих единиц - КОЕ) определяли методом предельных разведений при высеве на полужидкие питательные среды (0.2% агара). Активную кислотность среды (pH) определяли по-тенциометрически (Pocket-Sized pH Meter, Hanna Instruments, Португалия).
Активность ферментов декстраназы, а-амила-зы, полигалактуроназы, целлобиазы, инвертазы и в-галактозидазы измеряли по осахаривающей способности, используя в качестве субстратов 1%-ные растворы декстрана, растворимого крахмала, пектовой кислоты, целлобиозы, сахарозы и лактозы в 0.1 М Na-ацетатном буфере (рН 5.0). Редуцирующие вещества, образовавшиеся при гидролизе декстрана, растворимого крахмала и пектовой кислоты, определяли феррицианидным методом [15]. Для оценки активности гидролаз при использовании в качестве субстратов целлобиозы и сахарозы определяли содержание глюкозы, используя глюкозоксидазу (Львовский з-д биопрепаратов, Украина) и пероксидазу ("Reanal", Венгрия), [16]. Активность ферментов (Е) выражали в ед./мл среды. За единицу активности фермента принимали такое количество фермента, которое при действии на субстрат за 1 мин при 37°С освобождает редуцирующие вещества, эквивалентные 1 мкмолю глюкозы. Расчет вели по формуле
E = CN/1180.
Е - активность фермента, ед.; С - концентрация глюкозы в реакционной смеси, мкг/мл; N - разведение фермента; t - время гидролиза, мин.
Для характеристики продуцирующей способности клеток активность гидролаз выражали в ед./мг биомассы. Удельную скорость роста ц вычисляли по формуле ц = dx x-1 dr1, где dx - изменение биомассы x за промежуток времени dt. Удельную скорость синтеза ферментов (е) вычисляли по формуле е = dEdr1*-1, где x - биомасса (мг/мл), dE - прирост активности (ед./мл) за промежуток времени dt [17].
Антибиотикорезистентность молочнокислых и бифидобактерий оценивали по накоплению биомассы при культивировании на стандартных сре-
Таблица 1. Резистентность бифидо- и молочнокислых бактерий к различным концентрациям антибиотиков в среде культивирования
Группа Антибиотик B. adolescentis Lactobacillus sp.
91-БИМ 94-БИМ мг/100 мл рост
мг/100 мл рост мг/100 мл рост
Пенициллины Ампициллин 1.5 - 1.5 + 0.75 -
Бензилпенициллин 1.0 - 0.5 + 0.5 +
Бициллин-3 1.0 - 1.0 + 0.5 +
Бициллин-5 1.0 - 1.0 + 0.5 +
Карбенициллин 2.0 - 2.0 + 1.0 -
Цефалоспорины Максипим 1.0 - 1.0 - 0.5 ++
Фортум 1.2 + 1.2 + 1.2 ++
Цефазолин 0.6 - 0.6 + 0.3 +
Аминогликозиды Гентамицин 0.05 ++ 0.05 ++ 0.05 +
Канамицин 0.6 ++ 0.6 ++ 0.6 ++
Нетромицин 0.1 ++ 0.1 ++ 0.1 ++
Тетрациклины Доксициклин 1.2 - 1.2 - 0.6 ++
Амфениколы Левомицетин 4.0 ++ 4.0 ++ 3.0 +
Макролиды Эритромицин 1.0 - 1.0 - 0.5 ++
Ансамицины Рифампицин 1.0 - 1.0 + 0.5 +
Линкозамиды Линкомицин 0.01 - 0.02 - 0.01 -
Амфотерицин 1.0 ++ 1.0 ++ 1.0 ++
Оксамп 1.0 - 1.0 + 0.5 -
Стрептомицин 1.5 ++
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.