МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, том 45, № 3, с. 538-545
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ ^^^^^^^^^^ КЛЕТКИ
УДК 577.21:575.224:618.32
ПРОФИЛЬ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК В ПЛАЦЕНТАРНЫХ ТКАНЯХ ЧЕЛОВЕКА
© 2011 г. Е. Н. Толмачёва*, А. А. Кашеварова, Н. А. Скрябин, И. Н. Лебедев
Научно-исследовательский институт медицинской генетики Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, Томск, 634050 Поступила в редакцию 23.11.2010 г.
Принята к печати 24.12.2010 г.
Впервые с помощью метилочипа "Infinium HumanMethylation27 BeadChip" ("Illumina", США) установлен характер метилирования ДНК в цитотрофобласте хориона и во внезародышевой мезодерме человека — плацентарных тканях, которые являются производными трофэктодермы и внутренней клеточной массы бластоцисты и отличаются по динамике эпигенетического репрограммирования генома на самых ранних этапах дифференцировки. Установлено, что геном клеток внезародышевой мезодермы более метилирован, чем цитотрофобласт, что подтверждает данные, полученные ранее при исследовании других видов млекопитающих. Обнаружены отличия в характере метилирования одиночных CpG-динуклеоти-дов и динуклеотидов, локализованных в пределах промоторных CpG-островков. Большинство одиночных CpG-динуклеотидов в обеих обследованных тканях находится в метилированном состоянии, тогда как сайты в промоторных CpG-островках преимущественно не метилированы. При сравнительном исследовании идентифицировано 202 дифференциально метилированных гена во внезародышевой мезодерме и 40 генов в цитотрофобласте хориона. Все они отвечают за разнообразные биологические процессы, но во внезародышевой мезодерме основная часть генов контролирует связывание ДНК и активность транскрипционных факторов, а в цитотрофобласте — транспорт и секрецию белков и цитокинов.
Ключевые слова: цитотрофобласт, внезародышевая мезодерма, метилирование ДНК, дифференциально метилированные гены, метилочип "Infinium HumanMethylation27 BeadChip".
DNA METHYLATION PROFILE IN HUMAN PLACENTAL TISSUES, by E. N. Tolmacheva*, A. A. Ka-shevarova, N. A. Skryabin, I. N. Lebedev (Research Institute of Medical Genetics, Sibirian Division, Russian Academy of Medical Sciences, Tomsk, 634050 Russia, *e-mail: kate.tolmacheva@medgenetics.ru). For the first time using genome-wide Infinium HumanMethylation27 BeadChip Array (Illumina, USA) DNA methyla-tion pattern was determined in the human cytotrophoblast and extraembryonic mesoderm. These tissues are the derivatives of trophectoderm and inner cell mass of blastocyst and have substantial differences in dynamics of epigenetic genome reprogramming during early stages of differentiation. The genome of the extraembryonic mesoderm cells has been shown to be more methylated compared to the cytotrophoblast similarly to other mammalian species. Differences in methylation pattern of single CpG-dinucleotides and dinucleotides localized within promoter CpG-islands have been found. It has been shown that the majority of single CpG-dinucleotides in both tissues were methylated whereas promoter CpG-island sites were not. Comparative analysis revealed 202 differentially methylated genes in extraembryonic mesoderm and 40 genes in cytotrophoblast. These genes are responsible for diverse biological processes. However, in the extraembryonic mesoderm the main functional groups included genes responsible for DNA binding and transcriptional factors' activity whereas in the cytotrophoblast — for transport and protein and cytokine secretion.
Keywords: cytotrophoblast, extraembryonic mesoderm, DNA methylation, differentially methylated genes, genome-wide Infinium HumanMethylation27 BeadChip array.
Одним из центральных положений генетики индивидуального развития является представление о дифференциальной экспрессии генов в ходе онтогенеза, которая составляет фундамент эпигенетических процессов. Накопленные на сегодняшний
день данные убедительно свидетельствуют о том, что материальная основа эпигенетических феноменов в значительной степени обусловлена стабильными, наследуемыми, но потенциально обратимыми модификациями хроматина, среди которых
Принятые сокращения: ДМС — дифференциально метилированные сайты.
* Эл. почта: kate.tolmacheva@medgenetics.ru
центральное место, безусловно, занимает метилирование ДНК. Метилирование играет ключевую роль в обеспечении таких молекулярно-генетиче-ских процессов, как регуляция генной экспрессии, инактивация Х-хромосомы, геномный имприн-тинг.
С развитием молекулярных технологий стало возможно одновременно анализировать статус метилирования множества генов. Несколько лет назад, вслед за завершением программы "Геном человека", стартовал проект "Эпигеном человека" (Human Epigenome Project) [http://www.epigenome.org], цель которого — систематизация данных об особенностях метилирования генома в разных тканях организма. Перспективы развития данного проекта связаны с получением тотальных данных о характере метилирования в тканях в разные периоды онтогенеза и при различных патологических состояниях.
В последние годы стали появляться данные об особенностях метилирования ДНК в плаценте [1, 2], однако в этих исследованиях плаценту часто рассматривают как единый орган, не учитывая того факта, что ткани, ее формирующие, имеют различное зародышевое и внезародышевое происхождение. Так цитотрофобласт ворсинок хориона (стволовая линия всех клеток будущей плаценты, из которой возникают якорный, инвазивный трофобласт и син-цитиотрофобласт) происходит из трофэктодермы — наружного слоя бластоцисты. В то же время, строма ворсинок хориона выстлана клетками внезароды-шевой мезодермы — производной эпибласта, формирующегося из внутренней клеточной массы и дающего впоследствии начало всем эмбриональным тканям. Очевидно, что гетерогенность происхождения основных клеточных компонентов плаценты может иметь эпигенетическую основу. Действительно, как показывают результаты исследований на модельных объектах, процессы тканеспецифич-ного метилирования ДНК в цитотрофобласте и внезародышевой мезодерме протекают по-разному [3]. Геном клеток цитотрофобласта, после завершения периода глобального эпигенетического репро-граммирования, метилируется в незначительной степени, тогда как геном внезародышевой мезодермы существенно метилирован. Не исключено, что наблюдаемые отличия могут быть объяснены необходимостью поддержания плюрипотентности клеток цитотрофобласта, по сравнению со значительно более специализированными клетками внезароды-шевой мезодермы.
Полученные нами ранее данные свидетельствуют о том, что аномальное метилирование некоторых генов контроля клеточного цикла в этих внеза-родышевых тканях характеризуется тканеспеци-фичностью и ассоциировано с возникновением мозаичных форм летальных числовых хромосомных нарушений у эмбрионов человека [4, 5]. Кроме того, именно эти ткани в большинстве случаев яв-
ляются объектом исследований при цитогенетиче-ском анализе репродуктивных потерь [6, 7]. В связи с этим, особое значение приобретают данные об особенностях эпигенетической организации данных тканей, прежде всего, — в ходе нормального индивидуального развития, что необходимо для дальнейшего изучения вклада аберрантных эпигенетических модификаций генома в этиологию тех или иных патологических состояний.
Цель настоящего исследования — сравнительная характеристика профилей метилирования ДНК в цитотрофобласте и внезародышевой мезодерме эмбриона человека на базе платформы "Infinium HumanMethylation27 BeadChip" ("Illumina", США), включающей 27578 CpG-динуклеотидов, локализованных в 14475 генах.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Настоящее исследование одобрено Комитетом по биомедицинской этике НИИ медицинской генетики СО РАМН. В анализ взяты образцы цитотрофобласта ворсинок хориона и внезародышевой мезодермы медицинского абортуса с кариотипом 46,XY, полученного с добровольного согласия женщины, решившей прервать (не по медицинским показаниям) нормально протекавшую беременность на сроке 7.5 недель.
Для анализа статуса метилирования геномную ДНК выделяли из нативных (некультивированных) тканей зародыша после стандартной обработки протеиназой К в течение 16 ч при 37°С с последующей экстракцией смесью фенола и хлороформа. Эпигенетический статус исследовали с помощью метилочипа "Infinium HumanMethylation27 Bead-Chip" ("Illumina", США), включающего 27578 CpG-динуклеотидов, локализованных в 14475 генах. Большинство CpG-сайтов в структуре данного чипа находятся в пределах промоторных регионов генов (от 1 т.п.н. до и 500 п.н. после сайта начала транскрипции), что имеет значение для дальнейшей интерпретации результатов по изучению влияния характера метилирования на экспрессию генов.
Геномная ДНК подвергалась бисульфитной конверсии с использованием набора "EZ DNA Methy-lation Kit" ("Zymo Research", США), согласно протоколу производителя. Далее проводили полногеномную амплификацию и ферментативное расщепление ДНК на фрагменты, которые затем подвергали очистке и наносили на гибридизацион-ную матрицу. Во время гибридизации фрагменты ДНК отжигались с локус-специфичными ДНК-праймерами, соответствующими метилированному или неметилированному состоянию цитозина. Далее удлиняли праймеры на одно основание с использованием DNP- и Biotin-меченных ddNTP. Флуоресценцию сигналов матрицы измеряли с помощью сканера "Illumina BeadArray Reader" ("Illumina",
CpG-динуклеотиды в CpG-островках (20006 сайтов)
Внезародышевая мезодерма 13% 6%
16%
Цитотрофобласт 4%
81%
Одиночные CpG-сайты (7572 сайтов)
80%
Внезародышевая мезодерма 37% 14%
Цитотрофобласт 22% 20%
49%
в < 0.2
в = 0.2-0.6
58% | в > 0.6
Распределение CpG-сайтов в плацентарных тканях эмбриона человека.
США). Данные анализировали, используя программный пакет "GenomeStudio Methylation Module" ("Illumina", США), который переводит интенсивность флуоресценции в количественную величину в соответствующую отношению флуоресцентных сигналов метилированных аллелей к сумме флуоресцентных сигналов метилированных и немети-лированных аллелей исследуемого локуса. Величина в непрерывна и может принимать любое значение от 0 до 1, где 0 соответс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.