БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 10, с. 1332 - 1354
УДК 577.24
ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ АНТИОКСИДАНТОВ
ХИНОЛЬНОЙ ПРИРОДЫ НА ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ КАРДИОЛИПИНА В ЛИПОСОМАХ*
© 2014 А.В. Лохматиков1,2, Н. Е. Воскобойникова1, Д.А. Черепанов3, Н.В. Сумбатян4, Г.А. Коршунова5, М.В. Скулачев6, Х.-Ю. Штейнхофф1, В.П. Скулачев2,5, А.Я. Мулкиджанян1,2,5**
1 Оснабрюкский университет, физический факультет, D-49069, Оснабрюк, Германия; электронная почта: amulkid@uni-osnabrueck.de
2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет биоинженерии и биоинформатики, 119991 Москва
3 Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН,
119071 Москва, Ленинский проспект, 31
4 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
химический факультет, 119991 Москва
5 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва
6 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
НИИ Митоинженерии, 119991 Москва
Поступила в редакцию 11.03.14 После доработки 28.05.14
В митохондриях млекопитающих молекулы кардиолипина служат основной мишенью окисления активными формами кислорода. Взаимодействие окисленных молекул кардиолипина с компонентами апоптозного каскада в свою очередь может приводить к гибели клеток. В настоящей работе в модельной системе (липосомы из бычьего кардиолипина) произведено сравнение действия хинол-содержащих синтетических и природных ам-фифильных антиоксидантов на перекисное окисление кардиолипина. Показано, что как убихинол, так и синтетические антиоксиданты, будучи добавленными в микро- и субмикромолярных концентрациях, полностью защищали липосомальный кардиолипин от перекисного окисления. Длительность их действия, однако, различалась, возрастая при наличии метоксильных групп (у синтетических производных убихинола), а также дополнительных восстановленных редокс групп (в случае родаминового и берберинового производных). Концентрация убихинола в мембране митохондрий существенно превышает использованные нами концентрации анти-оксидантов и, казалось бы, должна полностью предотвращать перекисное окисление митохондриального кардиолипина. В действительности этого не происходит, кардиолипин в митохондриях окисляется, и данный процесс блокируется катионными антиоксидантами (Ю.Н. Антоненко и др., «Биохимия», 2008, т. 73, с. 1273—1287). Мы предполагаем, что в митохондриях существует фракция кардиолипина, не защищаемая природным убихи-нолом; скорее всего, опасности перекисного окисления in vivo подвержены те молекулы кардиолипина, которые недоступны для крупных, диффундирующих в липидном бислое внутренней мембраны митохондрий гидрофобных молекул убихинола, поскольку входят в состав комплексов мембранных белков. Защитой именно этой фракции кардиолипина от перекисного окисления можно объяснить благоприятное терапевтическое действие небольших, амфифильных митохондриально-направленных антиоксидантов, способных электрофо-ретически накапливаться внутри митохондрий под действием мембранного потенциала.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: апоптоз, дыхательные суперкомплексы, активные формы кислорода, проникающие катионы, пластохинол, SkQ1.
Принятые сокращения: АФК, активные формы кислорода; МЛ, метиловый эфир линолевой кислоты; ААРН,2,2'-азобис(2-аминопропан)дигидрохлорид; BHT, 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол; CL, кардиолипин; C11-BODIPY581/591, 4,4-дифтор-5-(4-фенил-1,3-бутадиенил)-4-бора-3а,4а-диаза^-индацен-3-ундекановая кислота; decPQH2, децилпласто-хинол; decUQH2, децилубихинол; HPMC, 6-гидрокси-2,2,5,7,8-пентаметилбензохроман; MeO-AMVN, 2,2'-азобис(4-ме-токси-2,4-диметилвалеронитрил); MitoQH2, 10-(2,3-диметокси-5-метил-1,4-бензохинонил-6)децилтрифенилфосфоний; POPC, 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилхолин; POPG, 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилглицерин; Q6H2, убихинол-6; Q10H2, убихинол-10; SkQ, вещества, состоящие из проникающего катиона и хинона; SkQH2, восстановленные (хиноль-ные) формы SkQ; SkQ1H2, 10-(пластохинонил-6)децилтрифенилфосфоний; SkQ3H2, 10-(метилпластохинонил-6)децил-трифенилфосфоний; SkQBerbH2, 13-[9-(6-пластохинонил)нонилоксикарбонилметил]дигидроберберин; SkQT1H2, 10-(я-толухинонил)децилтрифенилфосфоний; SkQR1H2, 10-(пластохинонил-6)децилдигидрородамин 19.
* Приложение к статье опубликовано на сайте «Biochemistry» (Moscow), Vol. 79, issue 10, 2014. ** Адресат для корреспонденции.
Организмы, обитающие в аэробных условиях, постоянно сталкиваются с проблемой нейтрализации активных форм кислорода (АФК), которые могут образовываться при метаболических процессах [1]. К АФК относятся продукты неполного восстановления кислорода, такие как анионы супероксида (0~2) и молекулы перекиси водорода (Н202) [2, 3]. Наиболее разрушительными являются образующиеся при катализируемом ионами металлов разложении перекиси водорода гидроксил-радикалы (ОН'), скорость окисления которыми органических молекул ограничена лишь скоростью диффузии. АФК могут, повреждая важные компоненты клетки, такие как мембранные липиды (рис. 1) и молекулы ДНК [1], приводить к гибели клеток и деградации тканей [3—5]. Поэтому увеличение количества АФК в клетке служит одним из основных сигналов апоптоза — программированной
клеточной смерти — приводящего к устранению клеток, не способных к нормальному метаболизму [6—8].
В эукариотических организмах основным источником АФК являются митохондрии [1]. Около 2% молекул кислорода, поглощаемого митохондриями при физиологических условиях, превращаются в АФК в результате одноэлект-ронного восстановления [9]. Главными источниками АФК в митохондриях являются протон-переносящая МАОН:убихинон оксидоредуктаза (комплекс I) и убихинол:цитохром с оксидоредуктаза (цитохромный bc1 комплекс, комплекс III) [10—15]. При этом комплекс I продуцирует АФК в условиях обратного переноса электронов (от убихинола к NAD+) [16—18]. Комплекс III, напротив, генерирует АФК в условиях «прямого» электронного транспорта на стадии окисления молекулы убихинола. Это окисление прохо-
Рис. 1. Схема цепной реакции перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот, входящих в состав липидов, на примере тетралинолеилкардиолипина. Пероксид-радикал (ЯОО'), который может принадлежать другой липидной молекуле или иметь иную природу (например, перекись водорода), атакует атом водорода при бис-аллильном атоме углерода жирной кислоты, в результате чего на жирной кислоте образуется сопряженная радикальная п-система, включающая 5 атомов углерода, которая затем присоединяет кислород по одному из крайних атомов с образованием пероксид радикала. При этом конфигурация двойных связей перестраивается в форму сопряженного диена. Образовавшийся пероксид-ради-кал способен атаковать новый субстрат (ЬН) по цепному механизму. Несущий гидрофильную перекисную группу жирно-кислотный «хвост» кардиолипина может затем частично смещаться к поверхности мембраны (пунктирная линия) и взаимодействовать с гем-связывающим карманом цитохрома с, внося вклад в частичную денатурацию последнего и активацию пероксидазной активности гема цитохрома с [55, 60]
дит в две стадии с образованием в качестве ин-термедиата анион-радикала убисемихинона, способного в побочной реакции к одноэлект-ронному восстановлению кислорода [19, 20].
Вызываемый АФК ущерб можно предотвратить, используя митохондриально-направлен-ные антиоксиданты. Работа над подобными препаратами ведется в нескольких лабораториях [21—29]. В частности, в МГУ им. М.В. Ломоносова такого рода антиоксиданты разрабатываются на основе проникающих катионов [30]. Подобные катионы, названные Д. Грином «ионами Скулачева» [31], способны проходить в заряженном состоянии через биологические мембраны и перераспределяться в соответствии с трансмембранной разностью электрических потенциалов [32, 33]. Благодаря способности селективно накапливаться в энергизованных митохондриях, несущих отрицательный внутренний заряд по отношению к цитоплазме, такие соединения могут использоваться в качестве «локомотивов» для доставки лекарственных веществ в митохондрии [34, 35]. В МГУ синтезирована и испытана серия митохондриально-направленных антиок-сидантов, представляющих собой конструкции из проникающего катиона и антиоксиданта, обычно хинольной группы, разделенных С-10 линкером, что обусловило название всей линейки препаратов — 8кр-ионы, т.е. конъюгаты проникающих ионов Скулачева (8к) и хинонов (Р) [36—38]. В качестве проникающего катиона исходно использовали трифенилфосфониевую группу [32, 33]. В дальнейшем, в качестве проникающего катиона были также использованы и другие соединения, как искусственного (рода-мин-19 в случае 8крЯ1) [36], так и природного (берберин в случае 8крВегЪ) происхождения [39].
В качестве потенциального хинольного антиоксиданта в 8кр-ионах используется пласто-хиноновая группа (2,3-диметил-1,4-бензохи-нон) или ее аналоги. Восстановленная хиноль-ная форма 8кр иона (8крН2) является типичным антиоксидантом, способным прерывать цепные реакции перекисного окисления. Коэффициент распределения в системе «октанол : вода» для 8кр1 составляет ~10 000 [40—42], поэтому подобные ионы специфически накапливаются в липидном бислое, защищая его компоненты от окисления. Причем в митохондриях 8крН2 выступает в качестве возобновляемого антиоксидан-та, так как может происходить его постоянная «перезарядка» в дыхательной цепи [36, 37, 40].
В результате проведенного изучения действия 8кр-ионов было показано, что эти соединения способны защищать клетки в культуре от апоп-тоза, индуцированного АФК, предотвращая, в частности, фрагментацию митохондрий [36, 37,
39, 42—50]. In vivo были отмечены случаи предотвращения симптомов сердечно-сосудистых [51], онкологических [52] и глазных [53] заболеваний; кроме того SkQ-ионы увеличивали продолжительность жизни многих организмов, в том числе мышей [54].
Для антиоксидантов основным объектом защиты во внутренней мембране митохондрий, судя по всему, служат молекулы кардиолипина [40, 55], липида, представляющего собой два остатка фосфатидилглицерина, связанных друг с другом дополнительной молекулой глицерина через фосфатны
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.