БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2014, том 31, № 2, с. 104-109
УДК 577.2:616-06
ПРОФИЛИ ЭКСПРЕССИИ РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ ГЕНОВ В КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЯХ МЕЛАНОМЫ
© 2014 г. В. А. Мисюрин1, 2*, А. В. Мисюрин1, 2, А. Е. Лукина3, А. А. Крутов2, Л. А. Кесаева2, И. Н. Солдатова2, Т. В. Ахлынина1, 2, Н. А. Лыжко1, 2, О. С. Бурова2, Л. Ф. Морозова2, И. Н. Михайлова2, М. А. Барышникова2, А. Ю. Барышников2
Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачёва МЗ РФ; 117997, Москва, ул. Саморы Машела, 1; *электронная почта: vsevolod.misyurin@gmail.com 2Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН; 115478, Москва, Каширское ш., 24;
3Гематологический научный центр МЗ РФ; 125167Москва, Новый Зыковский пр., 4
Поступила в редакцию 06.09.2013 г.
Все больше данных говорит в пользу того, что раково-тестикулярные антигены (РТА) могут служить специфической мишенью при проведении иммунотерапии диссеминированной меланомы. Цель данного исследования — обеспечить основу для выбора наиболее подходящего РТА путем анализа экспрессии мРНК генов, кодирующих РТА, в клетках линий меланомы методом количественной ПЦР в реальном времени. Экспрессию генов GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD, SCP1, SEMG1, SPANXA, SSX1 и PRAME определяли в клеточных линиях mel P, mel Si, mel Mtp, mel II, mel Hn, mel Ibr и mel Kor, полученных из образцов опухолевого материала пациентов с метастатической мела-номой. Наиболее высокий уровень экспрессии в большинстве рассмотренных клеточных линий обнаружен у генов GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, SCP1, SPANXA, SSX1 и PRAME. Таким образом, продукты трансляции их мРНК можно рассматривать в качестве перспективных кандидатов на роль мишени для иммунотерапии.
Ключевые слова: меланома, клеточные линии, раково-тестикулярные антигены, иммунотерапия, экспрессия генов.
Б01: 10.7868/80233475514020054
Меланома кожи человека характеризуется высокой пролиферативной активностью и склонностью к быстрому метастазированию [1—3]. Заболеваемость меланомой в России составляет 5.46 случаев на 100 000 населения, и этот показатель имеет тенденцию к росту [4].
Несмотря на достижения последних лет, лечение меланомы кожи остается нерешенной проблемой. Способ хирургического удаления опухоли [2] эффективен только при локальных стадиях заболевания. Однако практика показывает, что чаще болезнь носит распространенный характер; крайне высок риск возврата болезни после проведения хирургического вмешательства [5]. Применение комбинированной химиотерапии, включающей такие препараты, как араноза, лизомустин, дакарбазин, производные платины, ограничено из-за высокой токсичности и высокой частоты рецидивов [1—4].
Исходя из необходимости поиска новых терапевтических подходов, широко изучались сигнальные пути патогенеза меланомы и механизмы
их ингибирования. К ним относятся сигнальный путь МАРК (митоген-активированных протеин-киназ: С-К1Т, NRAS, BRAF, MEK), PI3K/AKT (фосфоинозитол-3-киназный путь: PTEN, AKT). Выявление мутаций в генах, кодирующих указанные белки, позволяет подобрать клинически эффективные препараты, ингибирующие действие протеинкиназ [6, 7].
В случае распространенного метастатического поражения, иммунотерапия является перспективным методом противоопухолевого воздействия [8, 9]. Одним из направлений иммунотерапии является модуляция собственного противоопухолевого ответа. Так, например, препарат ипилимумаб взаимодействует с рецептором CTLA-4, который находится на поверхности Т-лимфоцита и препятствует процессу распознавания иммунной системой клеток опухоли как чужеродных организму. В клинических испытаниях было показано, что данный лекарственный препарат в качестве монотерапии увеличивает продолжительность жизни пациентов с диссеминированной мелано-
мой до 4 лет [10]. Кроме этого, для повышения способности Т-лимфоцитов вызывать специфический противоопухолевый иммунный ответ применяют блокаторы лигандов программированной клеточной смерти (PD-1) [6]. Однако нередко встречаются серьезные побочные эффекты при использовании данного вида терапии, такие, как колит, гепатит, токсический эпидермальный некролиз.
Следуют упомянуть о применении иммуностимуляторов — интерферона а и интерлейкина 2 [9, 11]. Терапевтические концентрации данных веществ значительно превышают физиологические, что приводит к развитию нежелательных побочных эффектов, таких, как лихорадка, грип-поподобный синдром [11].
Основными критериями, сформулированными исследователями при создании онколитиче-ских вакцин, являются безопасность применения, отсутствие токсичности для нормальных тканей и высокая клиническая эффективность, позволяющая с высокой специфичностью элиминировать опухолевые клетки [12, 13]. В качестве мишеней для применения онколитических вакцин рассматриваются раково-тестикулярные антигены (РТА), представленные на поверхности здоровых половых клеток, а также на мембранах опухолевых клеток, имеющих самое различное происхождение [14]. Половые клетки надежно защищены гематотестикулярным барьером, поэтому специфические подходы иммунотерапии, направленные против РТА, должны воздействовать только на опухолевые клетки [15].
Работы прошлых лет демонстрируют, что в ряде случаев специфическая иммунотерапия позволяла достичь полной ремиссии при диссеминиро-ванной меланоме. Так, одна группа исследователей использовала в качестве "магической пули" аутологичные Т-лимфоциты, а в качестве мишени — антиген №У-Е80-1 [16, 17]. Этот антиген входит в группу РТА, и ранее он был обнаружен на мембране клеток меланомы [18]. После выделения популяции Т-клеток, распознающих эпи-топы антигена NY-ESO-1, данные клетки были возвращены в кровоток пациента. Авторы обратили внимание, что полученные Т-лимфоциты обладали способностью к аутостимуляции, и не было необходимости в дополнительном введении цитокинов. Спустя несколько недель после ин-фузии аутологичных Т-лимфоцитов была достигнута полная ремиссия заболевания, сохранявшаяся в течение 2 лет [17].
Подобные результаты произвели глубокое впечатление на исследователей, однако последующие эксперименты показали, что излечение наступает только в 50% случаев. Кроме того, активная иммунотерапия остается очень дорогим и трудоемким методом [19].
Мы провели данное исследование с целью оптимизации стратегии терапии меланомы. Для этого мы методом количественной ПЦР в реальном времени исследовали экспрессию генов GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD, SCP1, SEMG1, SPANXA, SSX1 и PRAME, кодирующих РТА, на клеточных линиях, полученных от пациентов с диагнозом диссеминированная меланома.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клеточные культуры mel P, mel Si, mel Mtp, mel Il, mel Hn, mel Ibr и mel Kor, полученные из образцов опухолевого материала от пациентов с метастатической меланомой, были предоставлены НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей [14]. Культивирование клеточных линий проводилось в среде RPMI 1640, содержащей 10% бычьей сыворотки, 2 мМ Z-глутамина, 1% HEPES и 100 мкг/мл ампициллина. Суммарную РНК выделяли из клеток (в количестве 1 х 106) согласно [21], причем прикрепленные к субстрату клетки разрушали, добавляя лизирующий буфер прямо в культуральный флакон. Реакции обратной транскрипции проводили с использованием фермента RevertAid Reverse и набора реактивов (Fermentas, США) в условиях, предложенных фирмой-производителем. Для проведения одной реакции обратной транскрипции использовали 2 мкг РНК. Для отжига использовали смесь случайных шестичленных праймеров (Синтол, Россия). В качестве отрицательного контроля использовали рабочую смесь без добавления РНК, пробу доводили до конечного объема деионизованной водой. Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием двукратной реакционной смеси (40 мМ трис-HCl, 100 мМ KCl, 4 мМ MgCl2, 1 мМ каждого из четырех дезоксирибонуклеотидов и 0.2 мМ 2-МЭ) и Taq-ДНК-полимеразы в условиях, предложенных фирмой (Fermentas, США). ПЦР в реальном времени проводили с использованием прибора ICycler IQ, (BioRad, США). Системы специфических праймеров и зондов были разработаны на основе данных, предоставленных ресурсом http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Праймеры и флуоресцентные зонды синтезировали в компании Евроген, Россия. Для детекции использовали краситель Fam. В качестве положительного контроля использовали плазмиды, экспрессирующие клонированные геномные последовательности. Отрицательным контролем в реакции количественной ПЦР служила проба РНК, выделенная на предыдущем этапе. Правильность синтезированных нуклеотидных последовательностей подтверждали секвенированием по Сэнгеру на анализаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Специфичность систем прай-меров и зондов проверяли, проводя реакцию ко-
106
МИСЮРИН и др.
% 1000
100
10
%
1000 100 10 1 0.1
0
%
120 100 80 60 40 20
0
%
100 80 60 40 20
0
ABL GAGE1
■
■
NY-ESO-1 SEMG1 SSX1
1-1-1-1-1-1-1-1-г
MAGEA1 PASD SCP1
SPANXA PRAME
I NY
NY-ESO-1 PASD SCP1 SPANXA
T--г
ABL GAGE1 MAGEA1
ANXA SSX1
—i-1——i——i—^—i
SEMG1 PRAME
~r
~r
_
ABL GAGE1 NY-ESO-1 MAGEA1 PASD SCP1 SEMG1 SPANXA SSX1 PRAME
L.
~i-1-1-1-1-1-1-1-1-1
ABL GAGE1 NY-ESO-1 MAGEA1 PASD SCP1 SEMG1 SPANXA SSX1 PRAME
а
в
г
Профили экспрессии раково-тестикулярных генов GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD, SCP1, SEMG1, SPANXA, SSX1 и PRAME в культурах клеток меланомы: a — mel Hn, б — mel Ibr, в — mel IL, г — mel Kor, д — mel Mtp, е — mel P, ж — mel Si. Уровень экспрессии выражен в процентах относительно уровня экспрессии контрольного гена Abl.
%
1000 100 10 1 0.1
0
%
1000 100 10 1 0.1
0
%
1000 100 10 1 0.1 0
GAGE1
PASD
SPANXA SSX1
~г
~г
~г
ABL
NY-ESO-1 MAGEA1
-1-
SCP1 SEMG1
~г
ABL
GAGE1
PASD
NY-ESO-1 MAGEA1
SCP1 SEMG1 SPANXA
SSX1
PRAME
SEMG1 SPANXA
SSX1 ^^
PRAME
Рисунок. (Окончание).
личественной ПЦР в реальном времени на образце геномной РНК из крови здорового донора. Количественная оценка уровня экспрессии изучаемых генов проводилась относительно мРНК гена АЬ1. Методика получения численного показателя уровня экспрессии генов полностью соответствует представленной ранее [22].
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.