МИКРОБИОЛОГИЯ, 2012, том 81, № 3, с. 332-338
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 582.282.123.2.57.063.7:547.94
ПРОФИЛИ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ГРИБОВ РОДА PENICILLIUM,, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МНОГОЛЕТНЕЙ АРКТИЧЕСКОЙ И АНТАРКТИЧЕСКОЙ МЕРЗЛОТЫ, КАК ЭЛЕМЕНТЫ ПОЛИФАЗНОЙ ТАКСОНОМИИ
© 2012 г. А. Г. Козловский1, В. П. Желифонова, Т. В. Антипова, Б. П. Баскунов, Г. А. Кочкина, С. М. Озерская
Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов
им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Поступила в редакцию 17.05.2011 г.
Изучены профили вторичных метаболитов грибов подрода Pénicillium рода Pénicillium, выделенных из многолетней мерзлоты. Большинство исследованных штаммов синтезируют биологически активные вещества алкалоидной природы и поликетиды. Найден новый продуцент фумихиназолинов F и G. На основе профилей вторичных метаболитов, а также микро- и макроморфологических признаков были уточнены видовые наименования штаммов.
Ключевые слова: микроскопические грибы, подрод Pénicillium, вторичные метаболиты, таксономия.
Общепринятая идентификация пенициллов по микро- и макроморфологическим признакам часто не дает однозначных результатов, особенно для изолятов, выделенных из антропогенно нарушенных и малоизученных экстремальных местообитаний. В последние годы для идентификации грибов подрода Penicillium все чаще используется новая система — полифазная таксономия, в которой, наряду с микро- и макроморфологическими признаками исследуемых штаммов, используются профили их вторичных метаболитов [1, 2]. Таким образом, предполагается, что спектр вторичных метаболитов, продуцируемых грибами, выделенными из малоизученных экстремальных местообитаний, может помочь более точно определить их видовую принадлежность.
Цель работы — изучить профили вторичных метаболитов у штаммов грибов подрода Penicillium рода Penicillium, выделенных из многолетней мерзлоты и уточнить их таксономическое положение.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования служили 18 штаммов грибов рода Penicillium, полученных из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ РАН. Штаммы были выделены из арктических многолетнемерзлых отложений Колымской низменности - ВКМ FW-809, ВКМ FW-1447, ВКМ
1 Автор для корреспонденции (e-mail: kozlovski@ibpm.push-
chino.ru).
FW-2251, FW-2600, ВКМ FW-2604, ВКМ FW-2615, ВКМ FW-2648, ВКМ FW-2851, ВКМ FW-2876; из криопэгов Колымской низменности ВКМ FW-869, ВКМ FW-2753; из многолетнемерзлых грунтов Антарктиды ВКМ FW-2881, из воды близ побережья Антарктиды - ВКМ FW-2921, ВКМ FW-2928, а также из мерзлого вулканического пепла Камчатки — ВКМ FW-2665, ВКМ FW-2852, ВКМ FW-2853, ВКМ FW-2854 [3,4].
Идентификацию штаммов проводили по макро- и микроморфологическим признакам у 7-сут. культур, выращенных при температурах 5, 25 и 37°С на агаризованных средах CYA — среда Чапека с дрожжевым автолизатом, MEA — мальц экстракт агар и G25N — нитратный агар, содержащий 25% глицерина, YEA — дрожжевой экстракт с сахарозой, CYAS — среда Чапека с дрожжевым автолизатом, 5% NaCl [1, 5]. При изучении продукции вторичных метаболитов грибы культивировали глубинным способом на среде следующего состава (г/л дистиллированной воды): маннит — 50.0; янтарная кислота — 5.4; MgSO4 • 7H2O — 0.3; KH2PO4 — 1.0; рН доводили до 5.4 25%-ным раствором NH4OH. Грибы выращивали в 150 мл среды в колбах объемом 750 мл при 24 ± 1°С на качалке (220 об/мин). Засев среды осуществляли водной суспензией конидий (1—2 х 107 спор/мл) 14-сут. культур, выращенных на скошенном сусло-агаре. Отбор проб проводили на 11 сут культивирования.
Внеклеточные метаболиты кислой, нейтральной и щелочной природы извлекали из фильтрата
культуральной жидкости трехкратной экстракцией хлороформом по ранее описанной методике [6]. Анализ экстрактов осуществляли методом ТСХ на пластинках силикагеля (Silica gel F254, "Merck", Германия) в системах I и II: хлороформ— метанол—25%-ный NH4OH (90 : 10 : 0.1) (I) и (80 : 20 : 0.2) (II). Вещества обнаруживали по поглощению и флуоресценции в УФ-свете и после опрыскивания пластин реактивом Драген-дорфа для обнаружения азотсодержащих метаболитов, реактивом Эрлиха — индольных алкалоидов и 5% раствором FeCl3 в метаноле — фенольной группы.
Выделение и очистку метаболитов проводили препаративной ТСХ на пластинах силикагеля. Идентификацию метаболитов осуществляли со-хроматографией со стандартными образцами, полученными ранее в Лаборатории вторичных метаболитов ИБФМ РАН, а также другими физико-химическими методами. УФ-спектры соединений в метаноле получали на спектрофотометре UV-160 А, фирмы "Shimadzu" (Япония). Масс-спектры соединений регистрировали на масс-спектрометре LCQ Advantage MAX "Thermo Finnigan" (Германия), используя одноканальный шприцевый насос для прямого ввода образца в камеру с целью химической ионизации при атмосферном давлении. Сбор и обработку масс-спек-трометрических данных осуществляли с помощью программного обеспечения Xcalibur. Более полную информацию для детекции метаболитов получали при анализе как положительных, так и отрицательных ионов. МС/МС спектры получали при нормализованной энергии столкновений 20-40%.
Эпимеризацию метаболита 10 (фумихиназо-лин F) в метаболит 11 (фумихиназолин G) проводили следующим образом. 1 мг метаболита 10 выдерживали в 100 мкл 40% раствора КОН-MeOH (1 : 99) в течение 16 ч. Объем раствора доводили до 1 мл Н2О (дист.), подкисляли 0.1 М раствором HCl до ~ рН 4 и экстрагировали хлороформом (об/об). Хлороформенный экстракт высушивали над Na2SO4 и упаривали на роторном испарителе. Сухой остаток анализировали с помощью ТСХ в системах растворителей I и II.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На основании данных по профилям вторичных метаболитов штаммов грибов, выделенных из различных районов многолетней мерзлоты, было установлено, что 17 из 18 изученных культур способны синтезировать низкомолекулярные соединения разных типов (табл. 1). По спектру продуцируемых вторичных метаболитов штаммы можно разделить на группы. Самая многочисленная группа, в которую входят штаммы: ВКМ
^-1447, ВКМ ^-2753, ВКМ ^-2851, ВКМ ^-2853, ВКМ ^-2876, ВКМ ^-2881, ВКМ ^-2852, ВКМ ^-2854, синтезировала метаболит 1 с = 0.25 (I), дающий с реактивом Эрлиха фиолетовое окрашивание, указывающее на наличие индольной структуры в данном соединении. На основании физико-химических характеристик выделенного метаболита, которые практически совпали с литературными данными [7], и прямого сравнения со стандартным образцом данное соединение было идентифицировано как клавиновый эргоалкалоид а-циклопиазоно-вая кислота (ЦПК). У штаммов ВКМ ^-2852 и ВКМ Б"^2854 помимо ЦПК были обнаружены еще три метаболита, содержащие индол. УФ-спектры выделенных метаболитов являлись типичными для клавиновых алкалоидов (табл. 1). Молекулярная масса метаболита 2 (240 Да) и характер фрагментации в масс-спектре соответствовали структуре клавиновых эргоалкалоидов — фе-стуклавину и его изомерам: пироклавину, коста-клавину и эпикостаклавину. Молекулярные массы метаболитов 3 и 4 (298 и 256 Да) и их масс-спектры были характерны для фумигаклавина А и фуми-гаклавина Б и для их изомеров — изофумигакла-вина А и изофумигаклавина Б соответственно (табл. 1). Окончательное и однозначное доказательство идентичности метаболитов 2, 3 и 4 соответственно фестуклавину, фумигаклавину А и фумигаклавину Б, а не близким им по свойствам соответствующим изомерам, было получено в результате сохроматографии со стандартными образцами этих соединений. В качестве проявителей использовали системы растворителей I и II.
Следующая группа, представленная штаммами ВКМ ^-2600, ВКМ ^-2665, ВКМ ^-2604, ВКМ ^-2615, ВКМ ^-2921, ВКМ ^-2928, синтезировала метаболиты 5 и 6, которые на основании физико-химических свойств были идентифицированы как бензодиазепиновые алкалоиды — циклопенин и циклопептин. У штамма ВКМ Р^2615 был обнаружен также метаболит 7, идентифицированный как циклопенол (табл. 1). Штаммы ВКМ ^-2604, ВКМ ^-2921, помимо этих алкалоидов, синтезировали метаболит 8, который по своим физико-химическим характеристикам соответствовал хинолиновому алкалоиду вири-дикатину. Все эти метаболиты связаны единой биосинтетической цепочкой, их предшественниками являются фенилаланин, антраниловая кислота и метионин. Первым метаболитом на этом пути является циклопептин, из которого синтезируется цик-лопенин и циклопенол, далее преобразующиеся в хинолиновые алкалоиды виридикатин и виридика-тол.
Штамм ВКМ Б"^2251 синтезировал метаболит 9, который по своим физико-химическим характеристикам был идентичен метаболиту по-ликетидной природы — гризеофульвину (табл. 1).
Таблица 1. Физико-химические свойства выделенных метаболитов
Окраска с реактивами Хроматографиче- ская подвижность в системах Молекулярный ион и характеристические пики в МС/МС спектрах
№ метаболита Стандартный образец Эрлиха РеС13 Драген-дорфа УФ-спектр, ^мак^ нм
I II [М-Н]- [М+Н]+
1 ЦПК Фиолетовая Коричневая Оранжевая 0.25 0.55 223, 251(пл.), 281, 290 335, 180, 140 337, 182, 196
2 Фестуклавин » » 0.08 0.22 224, 275, 280, 292 239, 238, 223, 208 241, 210
3 Фумигаклавин А » — » 0.20 0.47 224, 275, 282, 292 297, 237 299, 24
4 Фумигаклавин Б » — » 0.05 0.10 222, 275, 281, 293 255, 185, 154 257, 239
5 Циклопенин Желто-зеленая Темно- зеленая » 0.50 0.70 213, 290 293, 250, 236, 222, 159 295, 264, 251, 239, 177
6 Циклопептин » » » 0.50 0.70 213, 290 279, 226 281, 253, 134, 120
7 Циклопенол » » » 0.45 0.65 211, 285 309, 252, 238, 175 311, 177
8 Виридикатин — » » 0.40 0.60 225, 240, 287, 309, 330 236, 208 238, 223, 192, 132
9 Гризеофульвин Серая 0.30 0.45 236, 252, 291, 324 351, 319, 307, 137 353, 321, 285, 215, 165
10 Фумихиназолин Б Сиреневая Оранжевая 0.35 0.55 207, 219, 270, 278, 289, 306, 322 357, 228 359, 230
11 Фумихиназолин О » - » 0.27 0.46 » » »
12 РС-2 Бледно-розовая 0.55 0.75 207, 230, 280 213, 195, 167, 139, 125, 111
* — не образует.
Метаболиты 10 и 11 с R/ = 0.35(1) и R/ = 0.27(1), которые давали сиреневую окраску с реактивом Эрлиха и положительную реакцию с реактивом Драгендорфа, были обнаружены у штамма ВКМ Б"^869. УФ-спектры этих
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.