»
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2006, том 32. № 6, с. 565-573
УДК 577.112.3 + 547.495.9
ПРОИЗВОДНЫЕ N-АМИДИНОПРОЛИНА И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В СИНТЕЗЕ ПЕПТИДОВ КЛАССИЧЕСКИМ И ТВЕРДОФАЗНЫМ
МЕТОДОМ
© 2006 г. С. В. Буров", Ю. Е. Москаленко, М. В. Леко, М. Ю. Дорош, Е. Ф. Панарин
Институт высокомолекулярных соединений РАН, 199004, Санкт-Петербург, В.О., Большой пр., 31 Поступила в редакцию 29.03.2006 г. Принята к печати 03.05.2006 г.
Приведен способ получения /V-амидинопролина - гибридной структуры, моделирующей ключевые особенности последовательности Arg-Pro. Установлено, что активация карбоксильной группы свободной аминокислоты приводит к образованию циклического побочного продукта, структура которого подтверждена данными ESI-MS, lU- и С-ЯМР-спектров. Показано, что получение ДЦме-зитиленсульфониламидино)-£-пролина с помощью Mts-производного 2-метилизотиомочевины сопровождается частичной рацемизацией. Синтез целевого продукта проведен путем модификации iV-амидинонролина мезитиленсульфохлоридом. Возможность использования А'-амидинопролина для /V-концевой модификации пептидной последовательности показана на примере синтеза аналога фрагмента (95-98) а-цепи фибриногена.
Ключевые слова: N-амидинопролин: неприродные аминокислоты; синтетические полипептиды.
ВВЕДЕНИЕ
Введение неприродных аминокислот в последовательность пептидов и белков широко используется при изучении взаимосвязи структура-активность. Возможность направленного изменения их физико-химических свойств делает эти соединения практически незаменимыми при получении высокоактивных аналогов пептидных гормонов, обладающих повышенной устойчивостью к энзиматическому расщеплению. В последние годы интерес к разработке новых методов синтеза и промышленного производства необычных аминокислот, значительно возрос в связи с их включением в состав большого количества лекарственных препаратов на основе пептидов и пептидомиметиков [1]. В этой связи актуальной задачей представляется получение новых неприродных аминокислот и их защищенных производных для использования в классическом и твердофазном пептидном синтезе.
Многочисленные литературные данные свидетельствуют о том, что модификация М-концевой пептидной последовательности может оказывать существенное влияние на активность аналога и
Сокращения: Mts - 2,4,6-триметилфенилсульфонил (мези-тиленсульфонил); Adoc - 1-адамантилоксикарбонил; Mtr -2,3,6-триметил-4-метоксибензолсульфонил; Рте - 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил: Pbf - 2,2,5,7,8-пентаметил-фуран-6-сульфонил; DIC - /VTV-диизопропилкарбодиимид.
#Автор для связи (тел./факс: (812) 323-36-07; эл. почта: burov@hq.macro.ru).
продолжительность его действия [2-4\. Одним из вариантов такой модификации является блокирование А^-концевой амино- или иминогруппы. Вместе с тем, в некоторых случаях для проявления биологической активности или обеспечения растворимости аналога в воде необходимо сохранение положительного заряда на А-конце пептидной цепи [5]. По литературным данным, взаимодействие заряженных концевых группировок способствует стабилизации квазициклической "биологически активной" конформации ряда пептидных гормонов [6]. Во многих случаях такая стабилизация происходит при участии боковой функции остатка аргинина.
Характерной особенностью аргинина является наличие высокоосновной гуанидиновой группы, способной сохранять положительный заряд при физиологическом значении рН. Благодаря этому рассматриваемая группировка может принимать участие в процессе специфического ионного взаимодействия лиганд-рецептор или энзим—субстрат. Гуанидиновая группа является ключевым структурным элементом большого числа природных и синтетических соединений, используемых в качестве лекарственных препаратов, пестицидов, высокоэффективных заменителей сахара, нуклеотидо- и пептидомиметиков [7]. Замена аминогруппы в структуре биологически активных природных соединений на высокоосновную гуанидиновую группировку во многих случаях позволяет значительно повысить эффективность и селективность их действия [8]. Вместе
Mts-HN NH (III)
Рис. 1. Схема получения А'-амидинопролина и его производных.
с тем, пептидная связь, образуемая остатком аргинина, является чувствительной к действию ряда ферментов, включая трипсин, тромбин, фактор коагуляции Ха и клострипаин. Поэтому представляет интерес синтез неприродных аналогов аргинина, сочетающих высокую основность с устойчивостью к энзиматическому расщеплению.
В литературе описано большое количество аналогов природных аминокислот, содержащих гуа-нидиновую группу, включая производные фенил-аланина, глицина, глутаминовой кислоты, пролина и других. Применение А'-амидинопролина в качестве гибридной структуры может представлять особенный интерес ввиду наличия в ¿V-концевой части многих биологически активных пептидов последовательности Arg-Pro [6]. При этом включение одного из атомов азота гуанидиновой группы в пятичленный цикл пролина позволяет ограничить ее конформационную подвижность.
Известные из литературы примеры использования аналогов гуанидинопролина в пептидном синтезе относятся к соединениям, содержащим модифицированную кольцевую структуру или блокированную гуанидиновую группу [9-11]. Некоторые из таких аналогов производятся канадской фирмой "BioQuadrant Inc." и используются при получении пептидомиметиков и поиске новых биологически активных веществ методами комбинаторной химии. Немодифицированный ¿V-амиди-нопролин описан в числе многочисленных аналогов креатина [12]. В работе [13] предложена усовершенствованная методика получения защищенных гуанидинов, возможности которой показаны на примере синтеза бензилового эфира N-(Cmc-mpem-бутилоксикарбониламидино)-/.-пролина. В то же время нам не удалось обнаружить литературных данных относительно применения А'-амидинопролина и его производных в области пептидной химии.
Особенности синтеза с использованием рассматриваемой аминокислоты связаны с ее высокой гид-рофильносгью, определяющей хорошую растворимость в воде и практически полную нерастворимость в органических растворителях. Кроме того, в процессе активации карбоксильной группы свободного А'-амидинопролина можно ожидать образования специфического побочного продукта. Поэтому применение данной аминокислоты в пептидном синтезе предполагает получение защищенных производных, растворимых в органических растворителях и исключающих возможность побочных реакций с участием амидиновой группы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Целью работы является получение защищенных производных А'-амидинопролина и изучение особенностей их применения в классическом и твердофазном пептидном синтезе.
Для блокирования гуанидиновой группы аргинина в классическом пептидном синтезе наиболее часто используют защиту протонированием, -N02, Z-, Вое- и Adoc-группировки [14]. При получении аргининсодержащих пептидов твердофазным методом, как правило, применяют Tos-, Mts-, Mtr-, Pmc- или Pbf-защиту [15]. В случае неприродных аналогов аргинина, защитная группировка может вводиться либо непосредственно, либо в процессе их получения при использовании защищенных гу-анидилирующих агентов [16]. На первом этапе работы нами были исследованы два варианта получения производных А'-амидинопролина: исходя из незащищенного А'-амидинопролина или путем гуанидилирования пролина с помощью реагентов, несущих соответствующую защитную группу (рис. 1) [17]. yV-Амидинопролин (I) может быть получен в результате взаимодействия цианамида и пролина при кипячении в водно-спиртовой сре-
де. Поскольку наиболее простым способом блокирования гуанидиновой (и амидиновой) группы является защита протонированием, прежде всего нами была исследована такая возможность. При этом с целью улучшения растворимости продукта в органических растворителях в качестве противо-иона использовали лш/?а-толуолсульфонат. Полученный яя/?а-толуолсульфонат А-амидинопролина обладал хорошей растворимостью в диметилфор-мамиде; однако попытки активации карбоксильной группы с помощью А^АР-диизопропилкарбоди-имида в присутствии 1-гидроксибензотриазола приводили к практически количественному образованию побочного продукта, имеющего высокую электрофоретическую подвижность. Поэтому в ходе дальнейшей работы исследовались другие методы блокирования амидиновой группы.
Одним из перспективных вариантов представлялось применение щелочнолабильной трифтор-ацетильной защиты. Литературные данные относительно возможности трифторацетилирования гуанидиновой группы аргинина противоречивы. Так, в работе [18] сообщается, что при обработке ди-хлоргидрата эфира аргинина трифторуксусным ангидридом происходит образование только А^У-бис-замещенного производного. Вместе с тем недавно трифторацетильная группировка была предложена в качестве ортогональной защиты при использовании замещенных гуанидинов в классическом и твердофазном пептидном синтезе [19]. При этом авторы применяют многостадийную схему синтеза, предусматривающую применение замещенных производных тиомочевины. В то же время в некоторых предшествующих работах содержатся указания на возможность прямого трифторацетилирования гуанидиновой группы [20].
Мы исследовали два варианта получения три-фторацетильного производного, исходя из свободного А-амидинопролина: а) действием три-фторуксусного ангидрида в трифторуксусной кислоте и б) действием лшра-нитрофенилтрифто-рацетата в пиридине. В последнем случае реакция не идет по причине низкой растворимости А-ами-динопролина. В первом случае, вне зависимости от условий проведения реакции (количества эквивалентов ацилирующего агента и времени выдерживания) вместо трифторацетильного производного наблюдалось образование побочного продукта, обладающего высокой электрофоретической подвижностью. Аналогичные результаты были получены нами ранее при попытках активации карбоксильной группы гсара-толуолсульфоната А-амиди-нопролина.
Сопоставление масс-спектров полученного продукта и исходного А-амидинопролина (рис. 2) свидетельствует о значительной склонности рассматриваемых соединений к образованию кластеров. В случае исходного вещества наблюдаются
дополнительные сигналы соответствующего ди-мера и т
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.