РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2011, том 51, № 6, с. 660-669
МОДИФИКАЦИЯ РАДИАЦИОННЫХ ЭФФЕКТОВ
УДК [57+61]::539.1.04:616-03:599.323.4
ПРОИЗВОДНЫЕ ОКСАЗОЛА КАК СОЕДИНЕНИЯ, МОДИФИЦИРУЮЩИЕ РАДИАЦИОННЫЕ ЭФФЕКТЫ В ОРГАНИЗМЕ МЫШЕЙ
© 2011 г. Е. Б. Бурлакова1, Ф. С. Духович2, Е. Н. Горбатова2, В. Д. Гаинцева1, Г. П. Жижина1, *, Т. М. Заварыкина1, Е. М. Молочкина1, Н. П. Пальмина1, М. А. Смотряева1, Ю. А. Трещенкова1, Л. Д. Фаткуллина1, Л. Н. Шишкина1, Е. Л. Мальцева1
1 Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва 2ФГУП "Государственный научно-исследовательский институт органической химии и технологии", Москва
Исследован новый класс веществ, проявляющих радиозащитное и радиосенсибилизирующее действие в зависимости от их концентрации. Радиозащитный эффект обусловлен, вероятно, резонансным поглощением энергии излучения и переводом ее в низкоэнергетические формы, а также реакциями с продуктами радиолиза воды. Изучено влияние 2,5-дифенилоксазола и ди[2-(5-фенилокса-золил)]бензола в различных концентрациях совместно с облучением на рост меланомы В-16 у мышей и среднее время жизни животных-опухоленосителей. При облучении и введении исследуемых препаратов в отдельных дозах отмечено увеличение средней продолжительности жизни мы-шей-опухоленосителей и уменьшение размеров опухолей, что позволяет сделать заключение о перспективности применения изученных веществ в лучевой терапии.
Радиочувствительность, выживаемость, меланома В-16, двойные разрывы ДНК, мембраны.
Повреждающее влияние ионизирующей радиации на клетку позволило использовать ее при радиотерапии злокачественных новообразований. История попыток химической сенсибилизации опухолей насчитывает уже несколько десятилетий, однако многие казавшиеся весьма плодотворными идеи пришлось оставить. Основной задачей сочетанной химио- и лучевой терапии остается снижение повреждаемости тканей живого организма при увеличении повреждающего действия излучения на опухоль. Большинство используемых для этого препаратов имеют недостаточную избирательность к опухолевым клеткам и высокую токсичность для организма. Следовательно, особенно актуальны поиск и применение новых соединений, селективно повышающих радиочувствительность опухоли [1, 2].
Цель настоящей работы — поиск новых эффективных радиопротекторов среди соединений, способных трансформировать энергию квантов ионизирующего излучения в низкоэнергетические формы; изучение селективности таких соединений в индукции эффектов радиационной защиты нормальных и радиосенсибилизации опухолевых тканей.
* Адресат для корреспонденции: 119334 Москва, ул. Косыгина, 4, ИБХФ РАН; тел.: (495) 939-74-64; факс: (499) 13741-01; e-mail: zhizhina@sky.chph.ras.ru.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Исследование общего токсического действия и безвредности 2,5-дифенилоксазола (ДФО) и 1,4-ди[2-(5-фенилоксазолил)]бензола (ДФОБ) проводилось в соответствии с "Методическими рекомендациями по изучению общего токсического действия фармакологических средств", одобренными Фармакологическим государственным комитетом Минздрава России.
Изучение радиозащитных и радиосенсибили-зирующих свойств ДФО и ДФОБ проводили, подвергая мышей общему воздействию рентгеновского излучения на установке "РУТ-200-20-3" в дозах 12 сГр (мощность дозы 44 сГр/мин) и 2— 10 Гр (0.73 сГр/с) при напряжении 210 кВ, силе тока 15 мА, с фильтром Cu 0.5 мм. Мышам-самцам линии Balb/c массой 18—20 г за 30 мин до облучения вводили внутрибрюшинно вышеназванные препараты в растворе ацетон—вода—твин (1 : 8, 7 : 0.3) в дозах: 1, 10, 20, 30, 40, 60, 80 и 100 мг/кг. В каждой группе было по 10 животных. Эффект изученных соединений оценивали по средней продолжительности жизни и выживаемости (в %) животных.
Выделение ДНК проводили с применением набора реагентов Diatom DNA Prep 400 (Лаборатория "Изоген", Россия), основанного на использовании лизирующего реагента с гуанидин-тиоцианатом. Набор реагентов обеспечивает высокую чистоту выделенной ДНК: оптическая
плотность ОD260/280 1.6—2.0 и гомогенность по молекулярной массе (2.6—3.3 х 107 Да). Наличие дву-нитевых разрывов (ДР) ДНК выявляли стандартным методом гель-электрофореза по электрофо-ретической подвижности ДНК в нейтральном 0.7%-ном агарозном геле, в буфере ТАЕ (рН 7.8) при постоянном напряжении V = 3.0 В/см. Гели окрашивали раствором 1 мкг/мл бромистого эти-дия и оцифровывали с помощью видеосистемы "Gel Imager 2". Обработку изображений осуществляли с помощью программ Gel Imager и Scion Image Beta 4.0.2. Среднее число N двунитевых разрывов ДНК вычисляли по формуле
S/S - S) = exp—N,
где S0 — площадь всего пика денситограммы, а S— площадь пика, ограниченная ординатой максимума пика контрольной ДНК [3].
Измерение микровязкости мембран осуществляли с помощью метода спин-зондов, используя ими-ноксильные стабильные радикалы: 2,2,6,6-тетраме-тил-4-каприлоил-оксипиперидин-1-оксил (зонд 1), локализующийся в поверхностных областях липи-дов, и 5,6-бензо-2,2,4,4-тетраметил-1,2,3,4-тетра-гидро-у-карболин-3-оксил (зонд 2), локализующийся в прибелковых областях липидов. Зонды вводили в суспензию эритроцитов в спиртовом растворе за 20—30 мин до регистрации спектров на ЭПР-спектрометре "Brucker-2000" и "EMX" ("Bruker"). Конечная концентрация радикалов в суспензии пробы объемом 200 мкл составляла 10-4— 3 х 10-5 моль/л, концентрация белка 4—5 мг/мл.
Из полученных спектров рассчитывали время вращательной корреляции тС, имеющее смысл периода переориентации радикала на угол я/2, по формуле для быстровращающихся радикалов:
tc = 6.65AH+ х ((/+1//—1)1/2 — 1)10-10 с,
где AH+ — полуширина центральной компоненты спектра (Гс), I+1 и I—1 — интенсивности низко-польной и высокопольной компонент спектра соответственно [4, 5].
Измерение содержания малонового диальде-гида проводили по общепринятой методике с помощью тиобарбитуровой кислоты [6].
Нами была разработана методика определения содержания ДФО и ДФОБ в организме лабораторных животных как в количественном, так и в качественном вариантах на приборе "TLS/Scan-ner" фирмы "Camag" по флуоресценции тканей после воздействия ультрафиолетового света.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Физико-химические свойства производных окса-зола. Свойством трансформировать поглощенную энергию ионизирующего излучения до конечных форм — света и тепла обладают некоторые
протяженные ароматические системы. Способность ДФО и ДФОБ преобразовывать энергию излучения в световые вспышки используется в жидкостно-сцинтилляционном методе измерения радиоактивности [7]:
HC—N
V
гл
2,5-дифенилоксазол (ДФО),
HC—N и м
~CVC^ //
HC—N ,_,
Ди[2-(5-фенилоксазолил)]бензол (ДФОБ).
Диссипация энергии жесткого излучения обусловлена процессом образования множества каскадных переходов поглощенной энергии в исходном, возбужденном и ионизированном состояниях молекулы [1]. Процесс трансформации энергии рассматривался нами на основе статистической термодинамики. Исходной структурой предполагаемых радиопротекторов выбран 2,5-дифенилоксазол. При квантово-химических расчетах за основу принята модель, состоящая из подсистем: "хромофор", функция которой заключается в резонансном поглощении энергии излучения; "тепловой резервуар", осуществляющий внутримолекулярную конверсию поглощенной энергии; "ловушка" нестабильных радикалов и продуктов радиолиза воды. Квантово-химиче-ские расчеты показали возможность кратной ионизации молекулы ДФО при сохранении ее конфигурации (табл. 1).
При взаимодействии ДФО с жестким излучением возможен процесс изомеризации: 2,5-ДФО —- 4,5-ДФО
HC—N
// \\ -Ph-C C- Ph
O
hv
Ph^C-N
// W
Ph-C CH
V
Теплоты образования изомеров практически совпадают (65.734 и 65.976 ккал/моль). Теплота образования переходного состояния равна 148.925 ккал/моль. Данные изомеры существенно различаются по физико-химическим свойствам. В молекуле 2,5-ДФО я-системы электронов фе-нильных колец и пятичленного гетероцикла практически находятся в одной плоскости, тогда как в молекуле 4,5-ДФО плоскость одного из фе-нильных колец перпендикулярна к плоскости ок-сазола. Логарифмы коэффициента распределения (Р) октанол—вода различаются на 0.77 единиц (для 2,5-ДФО log P = 1.26, а для 4,5-ДФО log P = 0.49), что свидетельствует о большей гид-рофильности второго изомера. Теплоты образования комплексов данных изомеров с токсичным
Таблица 1. Некоторые свойства катионов, образующихся при ионизации молекулы ДФО
Параметры Заряд
д = 0 д = +1 д = +2 д = +3
АН, ккал/моль 65.734 249.652 515.762 880.651
ЕЭл, эВ -15180 -15157 -15108 -15031
Епт эВ 12583 12568 12531 12478
/еу, эВ 8.574 11.723 17.199 21.518
Примечание. д — заряд образующихся катионов; Еэл, эВ— энергия электронов частицы; -Епп, эВ — энергия отталкивания остов—остов; /еу, эВ— потенциал ионизации частицы.
Таблица 2. Острая токсичность соединений
Вещество Рецептура ЛД50, г/кг ЛД16, г/кг ЛД84, г/кг
ДФО ДФОБ Твин-80 (0.3 мл)+ ацетон (1.0 мл)+ вода (8.7 мл) Твин-80 (0.3 мл)+ ацетон (1.0 мл) + вода (8.7 мл) 1.60 (1.9-1.3) >3.00 1.40 2.20
продуктом радиолиза Н2О2 различаются на 8 ккал/моль также в пользу 4,5-ДФО. Можно предположить, что этот изомер должен обладать большей эффективностью как радиопротектор, чем 2,5-ДФО.
Молекула 2,5-ДФО — хороший акцептор электрона, она образует комплекс с Н2О2, теплота образования которого равна 33.742 ккал/моль. Образование комплекса с молекулой кислорода требует подвода энергии (13.84 ккал/моль). В отличие от молекулы 2,5-ДФО, являющейся хорошим "перехватчиком" продуктов радиолиза воды, но плохо реагирующей с молекулой О2, изомер 4,5-ДФО имеет возможность образовывать четырехчленный диоксетановый цикл, присоединив к связи С4=С5 молекулу кислорода. Распад диоксетана генерирует синглетные и три-плетные возбужденные состояния, и спектры люминесценции представляют собой суперпозицию флуоресценции и фосфоресценции диоксе-тана. Таким образом, для изомера 4,5-ДФО появляются дополнительная стадия в каскаде диссипации поглощенной энергии жесткого излучения и возможность резко снизить концентрацию продуктов радиолиза воды. Однако препараты ДФО и ДФОБ в модельных экспериментах не проявляют антирадикальных
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.