ОНТОГЕНЕЗ, 2007, том 38, № 5, с. 345-354
ОРГАНОГЕНЕЗ
УДК 591.3:591.481.1:597.5
ПРОЛИФЕРАТИВНЫЕ ЗОНЫ МОЗГА МОЛОДИ АМУРСКОГО ОСЕТРА. ВЗАИМООТНОШЕНИЕ С НЕЙРОМЕРАМИ И МИГРАЦИЕЙ ВТОРИЧНЫХ МАТРИЧНЫХ ЗОН1
© 2007 г. Е. В. Пущина, М. Ю. Флейшман*, С. С. Тимошин*
Институт биологии моря ДВО РАН 690041 Владивосток, ул. Палъчевского, д. 17 *Далъневосточный государственный медицинский университет 68000 Хабаровск, ул. Муравъева-Амурского, д. 35 E-mail: puschina@mail.ru Поступила в редакцию 24.11.05 г. Окончательный вариант получен 05.04.06 г.
С помощью иммуноцитохимического маркирования пролиферативиого ядерного антигена изучены процессы нейрогенеза переднемозгового отдела молоди осетра Ааретег schrenki. В мозгу молоди осетровых, как и у других видов костистых рыб, выявлен значительный пролиферативный потенциал. Зоны мозга АЫретег schrenki с высокой пролиферативной активностью располагаются у поверхности мозгового желудочка, относящейся к перивентрикулярной полости. Наряду с перивен-трикулярной зоной первичной пролиферации в переднемозговом отделе осетра выявлено несколько вторичных пролиферативных зон.
Ключевые слова: пролиферативные зоны мозга, нейрогенез, нейромеры, иммуноцитохимическое маркирование, осетровые.
Концепция нейромерной организации головного мозга костистых рыб, предложенная в 1950-х гг. Бергвистом и Калленом (Bergquist, Kallen, 1954), в исследованиях последних лет получает все большее распространение (Puelles, Rubenstein, 1993; Wullimann, Puelles, 1999; Muller, Wullimann, 2003). Установлено, что постэмбриональные стадии нейрогенеза рыб связаны с пролиферативной активностью вторичных матричных зон мозга (Ekstrom et al., 2001). Однако локализация этих областей и их взаимоотношения с центрами дифференциров-ки нейробластов, развитие которых определяет формирование нервных связей головного мозга, в настоящее время остаются неизученными. Показано, что у Danio rerio пролиферативные зоны (ПЗ) мозга связаны с паравентрикулярными областями. Также известно, что локализация ПЗ мозга ассоциирована с его эмбриональной сегментной организацией (Wullimann, Rink, 2002). Нейрогенез головного мозга хрящевых ганоидов практически не изучен. Однако в мозгу молоди осетровых, как и у других видов лучеперых рыб, обнаружен огромный потенциал к воспроизводству новых клеток. Chondrostei (осетры и веслоносы) являются наиболее древними представителями лучепе-
1 Работа поддержана Американским фондом гражданских исследований и развития (проект CRDF-Y2-B-03-05) и Министерством образования и науки РФ.
рых рыб, отделившимися от Holostei и Teleostei (группа Neopterygii) в палеозойский период и представляющими наиболее примитивную их ветвь. Головной мозг этих рыб развивается по пути эм-брионализации - задержки признаков ранних стадий онтогенеза до более поздних стадий индивидуального развития (Андреева, Обухов, 1999). Тем не менее морфогенетические принципы, детерминирующие высокую кинетику пролиферации клеток мозга, которая определяет уникальные репаратив-ные свойства центральной нервной системы рыб, а также процессы детерминации и дифференциров-ки нейронов в ходе постнатального нейрогенеза у осетровых, на сегодняшний день практически не изучены.
Цель настоящей работы - исследование мор-фогенетической организации перивентрикулярной и вторичных матричных зон переднего мозга молоди осетра Ааретег schrenki, а именно идентификация ПЗ переднемозгового отдела и картирование вторичных матричных зон теленцефали-ческого, промежуточного, таламического и гипо-таламического переднемозговых отделов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Для выявления ПЗ мозга и исследования мор-фогенетических феноменов у осетра Ааретег schгenki были использованы препараты, окра-
шенные гематоксилин-эозином по Нисслю (Меркулов, 1968), а также материал, иммуноцитохи-мически маркированный на пролиферативный ядерный антиген (proliferating cell nuclear antigen, PCNA). В работе использовали 10 особей молоди осетра в возрасте 60 сут. Животных анестезировали с помощью 0.1%-ного раствора трикаинметанс-ульфоната (MS-222, "Sigma", США), заливали в парафин по общепринятой методике (Меркулов, 1968) и готовили серийные трансверзальные срезы толщиной 5-6 мкм. Для выявления активности PCNA использовали метод непрямого авидин-био-тинового-пероксидазного (АВС-метод) иммунохи-мического мечения. Парафиновые срезы, наклеенные на полилизиновые стекла, депарафиниро-вали. Для увеличения проницаемости мембран использовали прогревание препаратов в течение 45 мин при температуре 95°C с водным раствором детергента (Target retrieval solution, "DAKO", США). После остывания до комнатной температуры стекла ополаскивали в дистиллированной воде. На срезы наносили 1%-ный раствор перекиси водорода на 0.1 М фосфатном буфере. Выдерживали 5 мин на водяной бане в термостате при 37°C, затем промывали стекла в трех сменах 0.1 М фосфатного буфера (pH 7.2) по 5 мин. На срезы наносили первичную мышиную моноклональную антисыворотку против PCNA ("DAKO", США) и выдерживали 20 мин на водяной бане в термостате при 37°C. Промывали стекла в трех сменах 0.1 М фосфатного буфера по 5 мин. На срезы наносили вторичные биотинилированные мышиные антитела против иммуноглобулинов кролика (LSAB 2 System, HRP, "DAKO", США). Выдерживали 20 мин на водяной бане в термостате при 37°C, промывали в трех сменах 0.1 М фосфатного буфера (pH 7.2) по 5 мин. На срезы наносили стрептави-диновую систему визуализации (LSAB 2 System, HRP, "DAKO", США). Выдерживали 20 мин на водяной бане в термостате при 37°C. Промывали стекла в трех сменах 0.1 М фосфатного буфера (pH 7.2) по 5 мин. Затем выявляли диаминобензи-диновые продукты гистохимической реакции. Таблетки диаминобензидина (ДАБ) предварительно растворяли по схеме в фосфатном буфере и приготавливали аликвоты по 1-2 мл. Перед нанесением в аликвоты добавляли 1%-ную перекись водорода на 0.1 М фосфатном буфере из расчета 5 мкл на 0.5 мл аликвоты. Выдерживали 57 мин на водяной бане в термостате при 37°C до визуализации маркера (процесс контролировали с помощью микроскопа). Промывали стекла в дистиллированной воде не менее 20 мин, а затем докрашивали срезы гематоксилином Лилли-Майе-ра 30 с, промывали проточной водой 15-20 мин, обезвоживали по стандартной методике и заключали в бальзам.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Топография пролиферативных матричных зон переднемозгового отдела осетра Acipenser schrenki. В работе использовали нейроанатомиче-скую номенклатуру Адрио с соавторами (Adrio et al., 1999), разработанную для хрящевых ганоидов. PCNA-иммунопозитивные клеточные формы картировали в соответствии с описанными нейро-генетическими прозомерными зонами (клеточных групп и волокон) костистых рыб (Diaz-Regueira, Anadón, 2000). Схема головного мозга осетра и границы нейромеров переднемозгового отдела приведены на рис. 1. Ростральная граница проходит через переднюю часть теленцефалона, а каудальной является область заднего бугорка промежуточного мозга (рис. 2). ПЗ ассоциированы с наружными границами мозга, а также с внутренними морфофункциональными комплексами (ядрами переднемозгового отдела). Выявленные ПЗ расположены в пограничной области между теленцефалическим и диенцефалическим отделами. В переднем мозгу (рис. 1) ПЗ ассоциированы с вентрикулярными зонами вентральной теленце-фалической области (субпаллиумом), дорсальной теленцефалической зоной (паллиумом), преопти-ческой областью (П5), вентральным (П3) и дорсальным таламусом (П2), эпиталамусом (П2), претектумом (П3), задним бугорком (П3) и гипоталамусом (П5). Полученные результаты демонстрируют, что дорсальная пролиферативная зона конечного мозга (ДД, ДЛ, ДМ), являющаяся областью эмбриональной эверсии, смещена лате-рально относительно геометрической вершины теленцефалона (рис. 2, а). Субпаллиальная пролиферативная зона включает дорсальную (ВД) и вентральную (ВВ) части (рис. 2, а). Преоптиче-ский регион содержит дорсальную мелкоклеточную (МкПЯ) и вентральную крупноклеточную (КкПЯ) пролиферативные зоны (рис. 2, б). Среди ПЗ промежуточного мозга в соответствии с ней-ромерной организацией мы идентифицировали хабенулярную, претектальную, перивентрику-лярные дорсальную и вентральную таламические клеточные скопления (рис. 1; 2, в). Вентрока-удально представлены три слабо выраженные, но тем не менее дискретно организованные зоны клеточной пролиферации. Две из них являются вентрокаудальным продолжением дорсальной и вентральной ПЗ таламуса и ассоциированы с зоной заднего бугорка (рис. 2, г-е), третья расположена в области ядра медиального продольного пучка (рис. 2, г, д). Были выявлены также несколько гипоталамических пролиферативных зон. ПЗ гипоталамуса, являющегося областью вторичного прозенцефалона, содержат нейромеры П4-П6, которые не формируют непрерывных областей (рис. 1). В дорсальной области PCNA-иммунореак-
Рис. 1. Схема прозомерной организации пролиферативных зон переднемозгового отдела осетра Acipenser schrenki. На сагиттальной проекции показана сегментарная организация переднего мозга осетра. ВД, ВЛ - дорсальная и латеральная зоны вентральной области конечного мозга; Ха - хабенула, Гип - гипофиз; ДД, ДЦ, ДМ, ДЛ - дорсальная, центральная, медиальная и латеральная зоны дорсальной области конечного мозга; ДПЯ - дорсальные перивентрикуляр-ные ядра; ДТ, ВТ - дорсальный и вентральный таламус; ЗЛ - заднелатеральная часть Area dorsalis, ЗтЯ - заднетубе-ральное ядро; КрС - крыша среднего мозга; М - мозжечок; ОЛ - обонятельная луковица; П1-П6 - прозомеры переднемозгового отдела; ПО - преоптическая область; ПЯ - претектальное ядро; СМ - сосудистый мешок; ЯМПП -ядро медиального продольного пучка; ПК - передняя комиссура.
тивные популяции были выявлены в области про-зомера П1 (ядра задней спайки), П2 (хабенулы), П3 (латерокаудального сегмента Area dorsalis (ЗЛ)) и П4-П5 (переднедорсальный регион Area dorsalis теленцефалона, промежуточный регион Area ventralis, дорсальный регион Area ventralis (ВД)). В вентральной области (прозомеры П3-П6) PCNA-иммунореактивные нейроны формируют гетероморфные группы: преоптическое, дорсальное и вентральное таламические ядра, ядро заднего бугорка, задне
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.