6. Селезнева Т. С., Борисова И. Э. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика 2008, 3, 18-21.
7. Методические указания 3.1.2943-11. М., 2011, 11 с.
8. Фельдблюм И. В., и др. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика 2005, 5, 30-33.
9. Селезнева Т. С. Эпидемиология и инфекционные болезни 2009, 2, 45-48.
10. Семенова Л. В., Романенко В. В., Скорюнова Т. В. Инфекция и иммунитет 2012, 1-2, 53.
11. Устинова О. Ю., Макарова В. Г., Долгих О. В. Анализ рисков здоровью 2013, 2, 27-38.
12. Ильина С. В., Савилов Е. Д. Эпидемиология и Вак-цинопрофилактика 2009, 4, 57-62.
13. Якимова Т. Н. Медицинский алфавит. Эпидемиология и санитария 2011, 4, 19-21.
14. Полтавченко А. Г., и др. Биотехнология 2013, 4, 78-82.
15. Раев М. Б. Клиническая лабораторная диагностика 2008, 2, 45-48.
16. Раев М. Б. Нанобиотехнологии в неинструментальной иммуноаналитике. Екатеринбург 2012, 140 с.
17. Тимганова В. П., Бочкова М. С., Раев М. Б. Доклады Академии наук 2013, 4, 492-495.
TRIPLE-ANALYTE DIAGNOSTIC SYSTEM FOR PERSONALIZED VACCINE
EFFICIENCY EVALUATION
Khramtcov P.
Federal State Institution of Science Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Perm, Russia
Semi-quantitative non-instrumental triple-analyte dot-blot test for personalized evaluation of the immunity level to infectious agents has been developed. Carbon nanoparticles covalently functionalized with streptococcal protein G have been used for visualization of results. Diagnostic system allows simultaneous estimating the antibody titer in human blood serum to pertussis, diphtheria and tetanus within 2 hrs. We evaluated anti-pertussis immunity level among children (n=43) in the age from 6 months to 12 years in Perm, Russia. Low level of seroprotection (23%) was demonstrated. Sensitivity of diagnostic system is 4-fold higher comparing to agglutination assay. Test-system advances like operation efficiency, simplicity, instrument-independence, visual detection of results signify perspectives of its application for personalized evaluation of the immunity level.
Key words: immunity level, dot-blot assay, functionalized nanoparticles, carbon nanoparticles, vaccination
ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ ОТВЕТ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК КРОВИ НА КСЕНОГЕННЫЕ И АЛЛОГЕННЫЕ ОПУХОЛЕВЫЕ АНТИГЕНЫ ПАЦИЕНТОВ С КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ РАКОМ
Шишков А. А.1, Селедцова Г. В.1, Кащенко Э.А.1, Мелащенко О. Б.2,
ФГБУ Научный исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск; 2ФГАОУ ВПО «<Балтийский федеральный университет им. Иммануила Канта», Калининград, Россия
Больным с диссеминированной формой колоректального рака проводилось иммуно-терапевтическое лечение с использованием ксеногенной противоопухолевой вакцины. До лечения и после индуцирующего курса вакцинотерапии (через 3 месяца) оценивалась пролиферативная активность мононуклеарных клеток крови на ксеногенные (LLC, B16) и аллогенные (BRO, Caco-2) АГ. После индуцирующего курса пролиферативный ответ лимфоцитов на все ксеногенные опухолевые АГ возрастал (на LLC с 9,1 до 15,1; на В16-с 3,8 до 12,9), что закономерно для используемых при иммунизации АГ. Зарегистрировано достоверное увеличение пролиферативного ответа и на аллогенные, неиспользуемые в лечении, опухолевые АГ аденокарциномного происхождения (Caco-2 с 1,7 до 5,9).
Ключевые слова: ксеногенные АГ, аллогенные АГ, колоректальный рак, вакцина РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014, том 8 (17), № 3
Противоопухолевый иммунитет включает в себя две линии защиты с различными характеристиками и функциями. Первая из них -природный (естественный) иммунитет, который реагирует на присутствие в организме чужеродного агента, в том числе измененных (мутированных) клеток. Механизм защиты в данном случае реализуется за счет нескольких типов клеток: NK-клеток, мононуклеар-ных клеток (моноциты циркулирующей крови и тканевые макрофаги), тучных клеток, ней-трофильных гранулоцитов и эозинофилов. Вторая линия- это соответствено адаптивный (специфический) иммунитет, который служит для реализации иммунного ответа путем формирования популяции высокоспецифичных лимфоидных клеток (Т-лф, ЦТЛ), призванных вести борьбу с развивающейся опухолью [№е1еу ^С, 2002, Yu Z., Restifo N. Р., 2002]. В ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН была разработана технология вакцинации онкологических больных опухолеассоциированны-ми антигенами мышиных опухолевых клеток, пилотные клинические испытания которой у пациентов с диссеминированной формой колоректального рака продемонстрировали безопасность и эффективность данного метода терапии [Фельде М.А., 2006, Se1edtsov V. I., 2006, 2007, 2011]. Данная работа посвящена
исследованию иммунологических механизмов реакции организма онкологического пациента в ответ на вакцинацию.
Материал и методы. В исследовании использованы клетки крови больных диссеми-нированной формой колоректального рака, проходившие лечение в Клинике иммунопатологии ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН.
Работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.93 № 2288), было получено разрешение локального этического комитета ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН № 67 от 20 января 2012 г.
Оценка пролиферативной активности мононуклеарных клеток крови. Из гепа-ринизированной крови стандартным методом выделяли мононуклеарные клетки (МНК). Лимфоциты культивировали в 96-луночных планшетах для иммунологических исследований при температуре 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2. Для стимуляции лимфоцитов использовали клеточные лизаты ксеногенных опухолевых линий (В16-меланома, LLC-карцинoма), опухолевых линий человека (Сасо-2-аденокарцинома сигмовидной кишки, Вго-меланома). В ка-
Таблица. Пролиферативный ответ МНК пациентов с колоректальным раком на ксеногенные и аллогенные опухолевые и контрольные АГ
Антиген до вакцинации (индекс пролиферативного ответа) после вакцинации (индекс пролиферативного ответа)
Карцинома мыши (LLC) (n=15) 9,1 ± 3,16# 15,1 ± 2,3**##
Меланома мыши (B16) (n=15) 3,8 ± 1,5 12,9 ± 1,65*#
Ксеногенный контроль (спленоциты мыши) (n=15) 2,9 ± 1,15 6,0 ± 0,82*
Меланома человека (BRO) (n=9) 1,3 ± 0,25 1,5 ± 0,37
Аденокарцинома кишечника человека (Caco-2) (n=9) 1,7 ± 1,5 5,9± 1,65#
Аллогенный контроль (МНК лизат) (n=9) 1,0 ± 0,7 2,8 ± 1,1
Примечание: *р<0,005 в сравнении с показателем до лечения; **р=0,01 в сравнении с показателем до лечения; #р <0,05 в сравнении с реакцией на неопухолевые антиген;
##р= 0,01 в сравнении с реакцией на неопухолевые антигены (критерий Манна-Уитни)
честве контроля к ксеногенным антигенам использовали клеточный лизат селезенки мыши, а к аллогенным антигенам - пулированный клеточный лизат мононуклеаров крови доноров. Интенсивность пролиферации оценивали через 120 ч по включению НЗ-тимидина. Подсчет радиоактивности материала производили в жидкостном сцинтилляционном счетчике SL - 30 (Intertechnic, Франция). Результаты представлены в виде индекса стимуляции (ИС), т.е. отношения уровня ответа в антиген-стимулированных культурах к уровню ответа в контроле. ИС = опыт (имп/мин) / контроль (имп/мин).
Результаты и обсуждение. Для оценки клеточного иммунного ответа и уровня сенсибилизации к опухолевым антигенам при ксено-вакцинотерапии больных колоректальным раком исследовали реакцию пролиферации лимфоцитов на ксеногенные (LLC, B16) и ал-логенные опухолевые (BRO, Ca^-2) и контрольные АГ по включению радиоактивного тимидина в пролиферирующие клетки. Клеточный лизат спленоцитов мыши был использован как контроль на ксеногенные антигены, лизированные аллогенные мононуклеарные клетки использовали в качестве неопухолевого аллогенного контроля.
Реакция пролиферации Т-лимфоцитов была оценена у пациентов до начала проведения и после индуцирующего трехмесячного курса ксеновакцинотерапии (табл.).
После индуцирующего курса вакцинотерапии выявлены достоверные различия между индексами стимуляции пролиферации на клеточный лизат карциномы мыши и меланомы мыши по сравнению с данными показателями до начала проведения лечения, соответственно (15,1 ± 2,3) (р=0,009) и (12,9 ± 1,65) (р=0,003). Отмечена пролиферативная реакция и на контрольные ксеногенные АГ (6,0 ± 0,82) (р=0,003), однако ее показатели более чем в 2 раза ниже значений, регистрируемых при добавлении ксеногенных АГ карциномы и меланомы мыши. Реакция на аллоген-ные опухолевые и контрольные экстракты у пациентов до начала лечения отсутствовала, после проведения курса иммунотерапии регистрировалось достоверное увеличение индекса стимуляции лишь на карциномные (Ca^-2) АГ.
Таким образом, проведенное исследование показало наличие сенсибилизированных лимфоцитов к карциномным ксено-, но не алло-антигенам, у больных до лечения. После индуцирующего курса пролиферативный ответ лимфоцитов на все ксеногенные опухолевые АГ возрастал (на LLC с 9,1 до 15,1; на В16- с 3,8 до 12,9), что закономерно для используемых при иммунизации АГ. Выявленная повышенная пролиферативная активность была связана, преимущественно, с реакцией на ксеноген-ные опухоль-ассоциированные, а не тканевые ксеногенные АГ. Зарегистрировано достоверное увеличение пролиферативного ответа и на аллогенные, не используемые в лечении, опухолевые АГ аденокарциномного происхождения (Caco-2 с 1,7 до 5,9).
Таким образом, развитие клинического ответа у пациентов, ответивших на вакцинотерапию, ассоциируется с выраженным пролиферативным ответом на аллогенные опухолевые клетки карциномы Сасо-2, превышающим значения до вакцинотерапии в 3,47 раза, что свидетельствует о высокой степени гомологии опухоль-ассоциированных антигенов опухолевых клеток больного с ксе-ногенными и аллогенными опухолевыми АГ. Обнаруженный факт позволяет нам сделать очень важный вывод: иммунизация больного колоректальным раком ксеногенными клетками карциномы и меланомы приводит к появлению в кровотоке лимфоцитов, специфично реагирующих на аллогенные клетки карциномы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Neeley Y. С., McDonagh K.T., Overwijk W. W., Res-tifo N. P., Sanda M. G. Prostate 2002, 53, 183-191.
2. Yu Zhi
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.