ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2010, том 57, № 3, с. 449-457
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ПРОЛИН РЕГУЛИРУЕТ УРОВЕНЬ ПОЛИАМИНОВ В РАСТЕНИЯХ ШАЛФЕЯ В НОРМАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ И ПРИ УФ-В ОБЛУЧЕНИИ
© 2010 г. Н. Л. Радюкина*, А. В. Шашукова*, С. Мапелли**, Н. И. Шевякова*, Вл. В. Кузнецов****
*Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва **Институт сельскохозяйственной биологии и биотехнологии, Милан, Италия ***Российский университет дружбы народов, Москва Поступила в редакцию 03.09.2009 г.
Растения шалфея (Salvia officinalis L.) в возрасте 4—5 настоящих листьев, выращенные в водной культуре, обрабатывали в течение 12, 24, 36 или 48 ч экзогенным пролином, внесенным в питательный раствор до конечной концентрации 5 мМ, подвергали действию УФ-B облучения (10 мин, 12.3 кДж/м2) или их совместному действию и определяли активность пролиндегидрогеназы (ПДГ) содержания пролина, свободной и конъюгированной форм полиаминов в листьях и корнях. Показали, что в присутствии экзогенного пролина его общее содержание в корнях через 12 ч экспозиции составило 9 мкмоль/г сырой массы, а в листьях повышение содержания пролина было обнаружено только через 24 ч и всего до 1 мкмоль/г сырой массы; в контроле в корнях и листьях содержание эндогенного пролина было близким к нулю. Содержание свободного путресцина повышалось после 10 мин облучения УФ-B в листьях и особенно в корнях. Индукция биосинтеза путресцина также наблюдалась в присутствии экзогенного пролина и начиналась раньше, чем при УФ-B облучении. Действие УФ-B затрагивало не только синтез путресцина, но и синтез спермидина и спермина, а также вызывало аккумуляцию их растворимых конъюгатов. Действие только экзогенного пролина усиливало синтез путресцина и ингибировало образование растворимых конъюгатов полиаминов. При совместном действии двух факторов индукция синтеза свободного путресцина в листьях имела тенденцию к увеличению, в корнях — к снижению. В то же время, содержание растворимых конъ-югатов полиаминов повышалось в листьях и корнях. Все вышесказанное можно рассматривать как косвенное доказательство связи биосинтеза пролина и полиаминов. Можно также утверждать, что искусственно созданная высокая концентрация пролина в растениях шалфея, характеризующихся его низким конститутивным уровнем, привела к нарушению гомеостаза низкомолекулярных метаболитов клеток и вызвала необходимость его восстановления различными путями. Это согласуется и с повышением активности ПДГ — ключевого фермента деградации пролина. Возможно, индукция биосинтеза полиаминов и изменение содержания их растворимых конъюгатов является одним из способов такого восстановления. При стрессе высокая концентрация пролина не является токсичной для растений, поскольку полиамины и пролин являются компонентами защитной системы растения, тем самым снижая повреждающее действие абиотических стрессоров.
Ключевые слова: Salvia officinalis — пролин — свободные полиамины — конъюгированные полиамины — пролиндегидрогеназа — УФ-В стресс
ВВЕДЕНИЕ
Стресс-индуцируемая аккумуляция низкомолекулярных метаболитов, обладающих мульти-функциональным защитным действием, является одной из ключевых "стратегий" адаптации растений к действию повреждающих абиотических факторов. Хорошо известно, что увеличение уровня свободного пролина - универсальная реакция растений на развивающийся в условиях стресса водный дефицит. Пролин - совместимый
Сокращение: ПДГ — пролиндегидрогеназа. Адрес для корреспонденции: Радюкина Наталия Львовна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Электронная почта: natrad@yandex.ru
осмолит, обладающий осморегуляторным действием, а также способностью предотвращать инактивацию ферментов и повреждение клеточных мембран и органелл. Кроме того, пролин контролирует экспрессию генов стрессорных белков, является источником азота, углерода и восстанавливающих соединений (например, НАД/НАД-Н), а также обладает антиоксидант-ным действием [1].
Важная роль в регуляции клеточного метаболизма в условиях стресса принадлежит и другому классу молекул — полиаминам, прежде всего, пу-тресцину, спермидину и спермину. Полиамины участвуют в межорганной передаче стрессорного
сигнала, в регуляции экспрессии генов стрессор-ных белков, обладают антиоксидантным эффектом [2]. Показано, что аккумуляция полиаминов и пролина, коррелирующая с повышением устойчивости, характерна для растений разных таксономических групп [1—5].
Общим предшественником при биосинтезе пролина и полиаминов является глутамат [1, 2]. Глутамат превращается в пролин в результате двух последовательных реакций, ключевым ферментом которых является пирролин-5-карбоксилат-синтетаза. В случае полиаминов глутамат служит более отдаленным предшественником, превращающимся сначала в орнитин или аргинин, которые являются субстратами двух ферментов (орнитинде-карбоксилазы и аргининдекарбоксилазы соответственно), катализирующих биосинтез путресцина — предшественника высокомолекулярных полиаминов (спермидина и спермина). В литературе мы нашли данные об аккумуляции в листьях рапса пролина, индуцированной осмотическим стрессом, которая ингибировалась полиаминами [6]. Подобного рода факты послужили основанием для гипотезы, согласно которой между метаболическими путями биосинтеза пролина и полиаминов существует конкуренция за единый предшественник [6, 7]. Несмотря на логичность высказанной гипотезы, сложно говорить об ее универсальности, поскольку обычно содержание пролина и полиаминов в растениях различается на порядок [8]. При этом пролин, в отличие от полиаминов, может накапливаться в свободном состоянии до довольно высоких концентраций и проявлять осморегу-ляторные и стресс-протекторные свойства. Однако недавно было обнаружено [9], что суперпродукция пролина может оказаться токсичной для клеточного метаболизма. О характере взаимодействия между путями регуляции накопления внутриклеточного пролина и полиаминов в растительных клетках в настоящее время известно очень мало. Так, найдено, что дифлюорометилар-гинин, ингибируя синтез путресцина из аргинина у эксплантов томатов, как в нормальных условиях, так и при стрессе, блокирует аккумуляцию пролина [3].
В литературе, посвященной изучению адаптационного процесса, высказывается также гипотеза, согласно которой аккумуляция пролина и полиаминов разобщены во времени, что позволяет говорить об их возможном различном вкладе в поддержание клеточного метаболизма на различных этапах адаптационного процесса [2]. В пользу этой точки зрения свидетельствуют, в частности, данные о том, что увеличение содержания полиаминов предшествует аккумуляции пролина [7]. Однако в условиях солевого шока имели место синхронные изменения эндогенного содержания пролина и полиаминов. Все это указывает на то, что вопрос о характере взаимоотношения
между метаболическими путями двух классов низкомолекулярных протекторных соединений -пролина и полиаминов — остается (особенно в стрессовых условиях) открытым.
При изучении этой проблемы подходящей моделью представляются растения шалфея, которые характеризуются очень низким конститутивным уровнем пролина [10]. Это позволяет искусственно увеличивать внутриклеточное содержание свободного пролина путем его добавления в куль-туральную среду; впоследствии пролин поглощается клетками корня и транспортируется в надземные органы. Подобный подход дает возможность анализировать уровни свободных и конъюгированных форм полиаминов на фоне различного, искусственно созданного содержания внутриклеточного пролина как в ходе нормального онтогенеза, так и при стрессе. Наименее изучено взаимодействие этих двух классов метаболитов в условиях УФ-В облучения, несмотря на то, что одним из непрямых эффектов УФ-В на растения является обезвоживание тканей, на которое растение реагирует повышением уровня эндогенного пролина, а также интенсивная аккумуляция полиаминов [11]. В связи с этим, цель настоящей работы заключалась в исследовании влияния экзогенного пролина на содержание полиаминов путресцинового ряда и их растворимых конъюгатов в растениях шалфея в контрольных условиях и при облучении УФ-В светом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объекта исследований были выбраны растения шалфея (Salvia officinalis L.). Семена проращивали в чашках Петри, после чего проростки переносили в перлит и в течение двух недель выращивали при подкормке 1/10 нормы питательной среды Джонсона, модифицированной по Winter [12]. После образования одного настоящего листа растеньица переносили в условия водной культуры с полной нормой питательной среды. Растения культивировали в камере фитотрона при 12-часовом световом периоде и освещении люминесцентными лампами Philips (F36W/54). Мощность освещения составляла 37.6 Вт/м2, температура воздуха — 23 ± 1/16 ± 1°С (день/ночь), относительная влажность воздуха — 55/70% (день/ночь).
В возрасте 6 нед. (4—5 настоящих листьев) часть растений облучали УФ-В светом в течение 10 мин при интенсивности радиации 12.3 кДж/м2, тогда как вторую группу растений не облучали. Затем половину облученных УФ-В и половину необлученных растений переносили на обычную питательную среду; вторую же группу растений каждого варианта выращивали на среде культивирования с 5 мМ пролина. Через 12, 24, 36 и 48 ч
Время, ч
Рис. 1. Содержание пролина в корнях и листьях и активность ПДГ в корнях растений шалфея. 1 — контроль; 2 — добавление пролина 5 мМ; 3 — облучение УФ-В; 4 — облучение УФ-В + пролин 5 мМ.
культивирования отбирали пробы листьев и корней для последующего анализа; материал фиксировали жидким азотом и сохраняли при -70°С.
Экстракцию и определение свободного пролина проводили по методу Bates с соавт. [13]. Для калибровки использовали пролин фирмы "Sigma" (США).
Активность пролиндегидрогеназы (ПДГ, КФ 1.5.99.8) определяли по методу Mattioni с соавт. [14].
Для определения свободных полиаминов и их НСЮ4-растворимых конъюгатов замороженный растительный материал гомогенизировали в 1.5 мл 5% HClO4, и экстракты центрифугировали 10 мин при 15000 g. Для получения растворимых конъюгатов аликв
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.