БИОХИМИЯ, 2011, том 76, вып. 11, с. 1505 - 1516
УДК 577.1
ПРОНИКНОВЕНИЕ КОРОТКИХ ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕННЫХ ПЕПТИДОВ В ЯДРО В КЛЕТКАХ HeLa И СПЕЦИФИЧЕСКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПЕПТИДОВ С ДЕЗОКСИРИБООЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ
И ДНК in vitro*
© 2011 г. Л.И. Федореева12, И.И. Киреев2, В.Х. Хавинсон3, Б.Ф. Ванюшин12**
1 ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, 127550 Москва, ул. Тимирязевская, 42
2 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва; электронная почта: vanyush@belozersky.msu.ru 3 Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, 197110 Санкт-Петербург, просп. Динамо, 3
Поступила в редакцию 23.04.11 После доработки 16.06.11
После инкубации клеток HeLa c флуоресцеин-изотиоцианатмеченными пептидами (эпиталон, AlaGluAspGly; пинеалон, GluAspArg; тестаген, LysGluAspGly) выявлена заметная флуоресценция в цитоплазме, ядре и ядрышке этих клеток. Значит, короткие биологически активные пептиды проникают в животную клетку и ее ядро и в принципе могут взаимодействовать с компонентами цитоплазмы и ядра, в том числе с ДНК и РНК. Разные исходные интактные пептиды по-разному влияют на флуоресценцию 5,6-кар-боксифлуоресцеинмеченных дезоксирибоолигонуклеотидов и комплексов бромистый этидий—ДНК. Константы Штерна—Фольмера при тушении пептидами флуоресценции разных по первичной структуре флуоресцентно-меченных дву- и однотяжевых дезоксирибоолигонуклеотидов значительно различаются в зависимости от первичной структуры пептидов. Это свидетельствует о специфическом взаимодействии разных коротких пептидов с нуклеиновыми структурами. При связывании с ними пептиды дискриминируют («распознают») не только определенные нуклеотидные последовательности, но и статус их цитозинового метилирования. Судя по соответствующим константам тушения флуоресценции, эпиталон, тестаген, пинеалон и бронхоген (AlaGluAspLeu) предпочтительно связываются с CNG-содержащими дезоксирибоолигонукле-отидами (CNG-сайты — мишени для цитозинового метилирования ДНК у эукариот), причем эпиталон, тестаген и пинеалон предпочтительнее связываются с CAG-, а бронхоген — с CTG-содержащими структурами. Сайт-специфические взаимодействия пептидов с ДНК могут эпигенетически контролировать генетические функции клетки. По-видимому, они играли важную роль в реализации генетической информации уже на самых ранних этапах возникновения жизни и в процессе эволюции.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: короткие биологически активные пептиды, связывание пептид—олигонуклеотид (ДНК), метилирование ДНК, регуляция генетических функций.
Пептиды образуют обширную и многообразную сигнальную регуляторную систему, контролирующую физиологию, рост и развитие животных и растений. Хорошо известно, что у живот-
Принятые сокращения: FAM — 5,6-карбоксифлуо-ресцеин, FITC — флуоресцеин-изотиоцианат, DAPI-4',6-диамидино-2-фенилиндол, ДРОН-дезоксирибоолигонук-леотид(ы), EB—ДНК — комплекс бромистого этидия с ДНК, ШФ — Штерн—Фольмер.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM11-126, 11.09.2011.
** Адресат для корреспонденции.
ных это связано с довольно крупными пептидами, большинство из которых — гормоны (нейро-пептиды, гормоны роста и многие другие). Функциональная роль очень коротких пептидов, состоящих, в частности, из 2—4 аминокислотных остатков, долгое время оставалась неясной и часто совсем недооценивалась. Тем не менее короткие пептиды в качестве сигнальных молекул могут запускать или ингибировать самые различные генетические процессы и биохимические реакции в клетке. Под влиянием коротких биологически активных пептидов средняя продолжительность жизни эксперименталь-
ных животных увеличивается на 30—40% и подавляется рост спонтанных, индуцированных и перевиваемых опухолей [1]. После введения мышам in vivo пептидов GluTrp, LysGlu, AlaGluAspGly, AlaGluAspPro у животных изменяется экспрессия генов в миокарде и головном мозге [1]. У трансгенных мышей такие пептиды в 2—4 раза подавляют экспрессию гена рака молочной железы HER—2/neu, что коррелирует с уменьшением размеров аденокарциномы [1]. У мышей и крыс короткие пептиды повышают экспрессию генов IL-2 и c-fos в лимфоцитах и различных структурах гипоталамуса, что во многом обусловливает иммуномодулирующие, онкомоди-фицирующие и стресс-протекторные свойства этих веществ [1]. Геропротекторное действие коротких пептидов связано с активацией хроматина в лимфоцитах крови пациентов старческого возраста [1]. Обработка эпиталоном (AlaGluAspGly) фибробластов человека способствует индукции теломеразной активности и удлиняет теломеры в 2,5 раза, что сопровождается увеличением на 42,5% числа делений клеток, т.е. при этом преодолевается так называемый лимит Хэйфлика [1]. У людей пожилого и старческого возрастов испытанные короткие пептиды повышают содержание мелатонина, улучшают различные физиологические функции и в 2 раза снижают смертность (в течение 8—12 лет рандомизированного клинического изучения) [1]. Некоторые флуоресцентно-меченные короткие пептиды способны проникать в животные клетки; они обнаруживаются в цитоплазме и сосредотачиваются вокруг ядра [2], однако до сих пор не ясно, способны ли они проникать собственно в ядро.
Считается, что в основе физиологического действия испытанных коротких пептидов лежит их ткане- или геноспецифичное взаимодействие с ДНК [1]. На самом деле речь может идти о сайт-специфическом связывании пептидов с ДНК. Это называют аллостерическим взаимодействием пептидов с ДНК [3]. Появились веские доказательства того, что связывание относительно коротких пептидов с ДНК действительно может быть сайт-специфичным, т.е. зависеть от первичой структуры пептидов и соответствующих узнаваемых ими участков (последовательностей) ДНК [3, 4]. Связывание коротких пептидов по большой бороздке ДНК сопровождается существенными локальными изменениями организации собственно двойной спирали ДНК [1] и экспрессии генов. Однако детальные механизмы такого избирательного связывания коротких пептидов с ДНК и обусловленной этим индукции или репрессии транскрипции генов все еще мало изучены. Несмотря на имеющиеся сведения о существовании и образовании
специфических комплексов разных относительно коротких пептидов с ДНК [1, 3—7], само сайт-специфическое взаимодействие и связывание таких пептидов c ДНК и возможность их вхождения в ядро клетки все еще часто подвергаются сомнению. Как бы ни было, уникальные особенности и закономерности (возможные правила) результативного в биологическом отношении связывания первичных структур собственно цепей ДНК и коротких пептидов практически все еще неизвестны.
В настоящей работе изучены внутриклеточная локализация разных флуоресцентно-меченных коротких биологически активных пептидов в клетках HeLa (после инкубации клеток c флу-оресцеин-изотиоцианат (FITC)-меченными пептидами) и взаимодействие (связывание) in vitro пептидов с различными синтетическими одно- и двутяжевыми дезоксирибоолигонуклео-тидами (ДРОН) и комплексами бромистый эти-дий—ДНК А,-фага (ЕВ—ДНК). О взаимодействии пептидов с олигонуклеотидами и ДНК судили по влиянию пептидов на спектры флуоресценции меченных 5,6-карбоксифлуоресцеином ДРОН, а также на спектры флуоресценции комплексов ЕВ—ДНК. В то же время изучено влияние ДНК на спектры флуоресценции FITC-меченных пептидов.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Мы использовали следующие пептиды — Эпи-талон® (AlaGluAspGly), Пинеалон® ^¡иАрАгя), Бронхоген® (AlaGluAspLeu), Тестаген® (LysGlu-AspGly), Кардиоген® (AlaGluAspAгg) и Панкра-ген® (LysGluAspTгp), синтезированные в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН. Чистоту синтетических пептидов проверяли, после чего дополнительно очищали их с помощью жидкостной хроматографии в хроматографе BioLogic DuoFlow (США) на колонке С-18 в градиенте концентрации (0—60%) ацетонитрила с 1%-ной трифторуксус-ной кислотой. Меченные 5,6-карбоксифлуорес-цеином (FAM) ДРОН с заданной первичной структурой были специально синтезированы и любезно предоставлены нам ЗАО «Синтол» (Москва).
Меченные FITC пептиды получали добавлением раствора FITC (1,5 мг/мл) в 0,5 М бикарбонате натрия к раствору пептидов (1 мг/мл). Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин при перемешивании. Полученные флуоресцентно-меченные пептиды анализировали и очищали от избытка свободного FITC с помощью хроматогра-
фии на хроматографе BioLogic DuoFlow в описанных выше условиях (рис. 1). Спектры флуоресценции (эмиссии) записывали на флуоресцентном спектрофотометре PerkinElmer-LS 55 (США).
А,-Фаговые ДНК были приобретены у фирмы «Fermentas» (Литва). В отличие от неметилиро-ванной ДНК (dcm-, dam) метилированная ДНК (dcm+, dam+) этого фага содержит остатки 5-ме-тилцитозина в последовательностях Cm5CWGG и остатки М6-метиладенина в Gm6ATC-сайтах.
Для изучения возможного проникновения в клетку и внутриклеточной локализации коротких пептидов клетки HeLa инкубировали в течение 12 ч с FITC-меченными пептидами (1,2 • 10-6 и 1,2 • 10-7 М), отмывали фосфатным буфером, фиксировали 1,8%-ным формальдегидом в течение 15 мин, инкубировали 10 мин с красителем DAPI (0,1 мкг/мл) и заключали в mowiol. Полученные препараты исследовали и фотографировали в флуоресцентном микроскопе Axiovert 200M («Zeiss», Германия) с охлаждаемой CCD-камерой Orca II-Erg («Hamamatsu», Япония). Контуры ядер выявляли по окраске ДНК DAPI. Среднюю внутриядерную флуоресценцию определяли с помощью программы ImageJ.
а для выполнения ими неких сигнальных функций в регуляции активности генов при связывании их, например, с ДНК высокая концентрация пептидов в ядре совсем необязательна. В отличие от относительно дискретного характера распределения флуоресцентной метки в цитоплазме флуоресценция в нуклеоплазме ядра относительно гомогенна и явно сильнее выражена в ядрышке (рис. 2). Таким образом, использованные флуоресцентно-меченные пептиды могут проникать в клетку, ее ядро и ядрышко. В принципе это является необходимым условием для возможного взаимодействия пептидов с нуклеиновыми структурами ядра и ядрышка. Обнаружение фл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.