ш
УДК 547.963.03:543.422.25:577.322.523
ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА ФРАГМЕНТА 87-136 БАКТЕРИООПСИНА
© 1997 г. И. В. Маслешшков", А. Л. Луговской, А. С. Арсеньев, Л. Д. Чикин, В. Т. Иванов
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117871, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16110 Поступила в редакцию 11.02.97 г. Принята к печати 16.04.97 г.
Методом двумерной спектроскопии 'Н-ЯМР исследована пространственная структура синтетического аналога фрагмента 87-136 бактериоопсина Halobacterium salinarium, солюбилизированного в смеси метанол-хлороформ (1:1), содержащей 0.1 М LiC104. Проведено полное отнесение сигналов с использованием спектров DQF-COSY, IOCSY и NOESY. Расчет пространственной структуры пептида 87-136 показал наличие двух спирализованных участков (остатки 92-100 и 108-130), соответствующих С-концевой части трансмембранного сегмента С и трансмембранному сегменту D бакте-риородопсина. Участок 92-100 образует правую а-спьраль, в то время как участок 108-130 может принимать различные спиральные конформации - правые а-спираль, 310-спираль и их комбинации. Сравнение полученных результатов с моделью структуры бактериородопсина по данным электронной криомикроскопии показало хорошее совпадение на участке 91-100 (среднеквадратичное отклонение координат атомов основной цепи не превышает 0.51 А) и гораздо большее отличие структуры на участке 108-130 (1.82 А). По результатам исследования предложена динамическая модель конформации трансмембранного сегмента D, проанализировано ее соответствие имеющимся данным о динамике бактериородопсина в процессе его функционирования.
Ключевые слова: бактериородопсин; белки, пептиды, мембранные белки, ЯМР; структуры -вторичная, пространственная.
Бактериородопсин (БР) - один из наиболее изученных мембранных белков [1,2]. По данным электронной криомикроскопии (ЭКМ) [3, 4] проведена реконструкция его пространственной структуры с разрешением 3.5 А, определены границы а-спиральных участков трансмембранных сегментов и охарактеризованы конформации боковых цепей аминокислотных остатков [4]. Результаты ряда исследований свидетельствуют о том, что в процессе функционирования БР происходят существенные конформационные изменения [5, 6]. Для выяснения природы этих изменений имеющейся модели БР [4] недостаточно. Использование теоретических методов молекулярной динамики для анализа структуры и динамики БР в мембране ограничено как существующими вычислительными мощностями, так и недостатками эмпирических потенциалов, которые
Сокращения: БР - бактериородопсин; БО - бактериоопсин; Nie - норлейцин; фрагмент 87-136 - [Nie118]БО-(87-136)-полипептид; ЭКМ - электронная криомикроскопия; СКО - среднеквадратичное отклонение; ДГА - дистанционный геометрический алгоритм; ЯЭО - ядерный эффект Оперхаузера; ¡¿-связи - межостаточные ЯЭО-контакты. # Автор для переписки (тел.: (095) 330-74-83, факс: (095) 335-50-33, e-mail: main@nmr.ru).
не позволяют корректно учесть мембранное окружение [7].
Спектроскопия ЯМР в последнее десятилетие стала альтернативным методом установления пространственной структуры и основным в исследовании процессов молекулярной динамики пептидов и белков как в водном растворе, так и в условиях, имитирующих гидрофобную среду биологических мембран [8]. Как было показано ранее [9], БР, солюбилизированный в смеси метанол-хлороформ, сохраняет вторичную структуру нативного белка в пурпурной мембране и обладает специфической третичной структурой. Индивидуальные фрагменты БР, выделенные после расщепления полипептидной цепи, также сохраняют в этой смеси органических растворителей конформацию, характерную для них в составе молекулы [10-12].
Эти наблюдения позволили применить методы спектроскопии ЯМР для установления детальной пространственной структуры трансмембранных сегментов БР. К настоящему времени проведен анализ данных ЯМР и рассчитаны пространственные структуры трансмембранных сегментов А [11-13], В [11-15], С, Е [16], Б [17] и О 116, 17], со-любилизированных в смеси метанол-хлороформ, а также сегмента А [13] и синтетического аналога сегмента В [18], встроенных в мицеллы. Охарак-
О),, м. д.
Рис. 1. (ЧН/МН-Область спектра NOESY (со[ = со2 = 7.4-9.0 м. д.) фрагмента 87-136 БО, солюбилизированного в смеси хлороформ-метанол (1 : I) с 0.1 М иСЮ4 при 30°С. Показано отнесение кросс-пиков Г^Н/М, + |Н.
теризована вторичная структура трансмембран-ного сегмента Э (остатки 102-136) [19]. Расчет пространственной структуры сегмента О в работе [19] не проводился, поскольку пептид 102-136 оказался полностью спиральным, за исключением С-концевых остатков 132-136, и было высказано предположение, что аминокислотная последовательность 102-136 несколько короче с !Ч-конца, чем соответствующий трансмембранный сегмент БР.
Настоящее сообщение посвящено ЯМР-иссле-дованию пространственной структуры [№е118]бак-териоопсин-(87-136)-полипептида. Им завершается цикл работ [11-19] по определению пространственных структур трансмембранных сегментов
БР, солюбилизированных в средах, моделирующих гидрофобное окружение мембраны.
Фрагмент спектра NOESY пептида 87-136 показан на рис. 1. Отсутствие минорных и неотне-сенных кросс-пиков свидетельствует о конфор-мационной однородности образца и отсутствии примесей. Результаты полного отнесения сигналов приведены в табл. 1, а схема ЯЭО-контактов показана на рис. 2. Данные, полученные при анализе спектров ЯМР и использованные в дальнейших расчетах, суммированы в табл. 2.
В результате расчета пространственной структуры фрагмента 87-136 по методу дистанционного геометрического алгоритма (ДГА, см. "Экспериментальную часть") получен набор из 20 структур (рис. 3), конформационная энергия которых
Таблица 1. Химические сдвиги сигналов протонов (5, ±0.01 м. д.) и времена полуобмена амидных протонов ИН на дейтерий растворителя (г1/2, ч) [Ме1181БО-(87- 136)-полипептида в смеси хлороформ-метанол (1 : 1) с 0.1 М иСЮ4 при 30°С
Остаток , * ' 1/2 Протоны
HN CaH** c[iH** Другие
Leu87 4.26 1.85, 1.85 cm 1.34, c% no, no
Pbe88 8.77 4.08 3.38, 3.30 C5H,CeH, C^H 7.46***
Thr89 10 7.68 4.40 4.39 cm3 1.33
Thr90 7.84 4.55 4.57 Cm3 1.44
Pro91 4.41 2.56,2.56 Cm 2.09, 2.33; CSH 4.01, 3.90
Leu92 7.45 4.24 1.92, 1.82 cm 1.81, с5н3 l.io, l.io
Leu93 <10 7.78 4.29 1.91, 1.96 cm 1.55, C5H3 1.09, 1.09
Leu 94 25 7.88 4.21 1.98, 1.76 cm 1.28, C8H3 1.09, 1.09
Leu95 60 7.97 4.23 1.89, 2.04 cm 1.75,C6H3 1.09, 1.09
Asp96 <10 8.42 4.56 2.95, 3.31
Leu97 15 8.35 4.13 1.98, 1.98 cm 1.27, CSM, 1.10, 1.10
A!a98 21 8.35 4.24 1.74
Leu 99 15 8.42 4.24 2.08,2.19 cm 1.28, C8H3 1.10, 1.10
Leu100 8.15 4.16 2.20, 2.20 cm 1.26, C6H3 1.09, 1.09
Val 101 100 8.68 3.79 2.41 cm3 1.14, 1.26
Asp 102 8.74 4.59 3.35,2.98
A la! 03 10 8.86 4.31 1.75
Asp104 8.95 4.66 3.35,3.02
Glnl05 8.88 4.22 2.49, 2.37 cm 2.57, 2.73; NEH 7.07, 6.52
Gly 106 14 8.42 4.08,4.08
Thrl07 <10 8.21 4.09 4.61 cm31.43
Ilel08 <10 8.04 3.86 2.20 cm 1.96, 2.17; cm3 1.39, CSH3 1.10
Leu 109 50 8.28 4.16 2.08, 2.08 cm 1.26, C5H3 1.09, 1.09
Alal 10 50 8.30 4.28 1.76
Leul11 60 8.30 4.25 J.80, 2.16 cm 1.28, C5H3 1.12, 1.09
Vail 12 60 8.73 3.85 2.41 cm3 1.17, 1.29
Gly 113 <10 8.70 4.07, 4.00
Alal 14 <10 8.62 4.25 1.77
Asp 115 8.74 4.64 2.93, 3.35
Glyl 16 <10 8.65 4.01, 3.98 cm 1.36, 2.16; cm3 1.99, CSH3 1.10
ile 117 16 8.30 4.03 2.28,
Niel 18 18 8.59 4.09 2.17,2.17 cm 1.48, 1.48; C8H 1.28, 1.28; CeH3 1.03
lie 119 16 8.78 3.94 2.11 cm 1.35,2.10; cm3 2.00, CSH3 1.11
Gly 120 <10 8.81 3.96, 4.05
Thrl21 <10 8.54 4.09 4.48 cm3 1.47
Glyl22 <10 8.35 4.05, 4.05
Leu 123 <10 8.61 4.33 2.11,1.87 cm 1.28, C6H, 1.11, 1.11
Val 124 30 8.44 3.81 2.38 cm3 1.16, 1.29
Gly 125 <10 8.87 3.97, 4.04
Alal26 <10 8.59 4.26 1.76 cm 1.28, C8H3 1.16, 1.10
Leu 127 25 8.65 4.18 2.09,2.04
Thr] 28 20 8.43 4.09 4.51 cm3 1.47
Lysl29 40 8.15 4.22 2.19, 2.19 cm 2.00, 2.00; C5H 1.75, 1.75; C£H 3.08, 3.08; N^H3 7,19
Vail 30 <10 8.29 3.83 2.38 cm3 1.27, 1.09
Tyrl31 <10 8.53 4.40 3.32, 3.32 C5H 7.27, CeH 6.88
Serl32 <10 8.24 4.40 4.19, 4.19 CSH 7.33, CEH 6.84
Tyrl33 7.90 4.55 3.25, 3.32
Arg 134 7.82 4.28 1.95, 1.86 Cm 1.56, 1.39; C8H 3.08, 3.08; NeH 7.18
Phc135 7.83 4.80 3.06,3.46 C8H, CEH, C^H 7.40***
Val 136 7.70 4.34 2.39 cm3 1.15, 1.15
* Времена полуобмена (г1/2) протонов ЫН определены по серии двумерных спектров ТОС5У. Отсутствие записи означает, что сигналы, соответствующие данному протону N11, отсутствовали в первом из серии спектре ЯМР, снятом в период 0.5-11 ч после растворения пептида. Запись "<10" означает, что сигналы от данного протона N1-1 наблюдались в первом, но отсутствовали во втором спектре ЯМР, снятом в период 11-21.5 ч после растворения пептида.
** Химические сдвиги пар протонов, для которых получено стереоспецифическое отнесение, указаны жирным курсивом в порядке, соответствующем росту нумерации протонов.
*** Химические сдвиги сигналов ароматических протонов совпадают у остатков РЬе88 и РЬе 135.
dm[i,i + 1 ] dm¡i,i + 2] <4N Ш + 'I ¿W'V + 4] daN[i,i + 3] dßN[i,i + 1]
H— D
МАСЛЕННИКОВ и др.
W777777Ä
87 90 100 110 120 130 136
LFTTPLLLLDLALLVDADQGTILALVGADGI XIGTGLVGALTKVYS YRFV штттшя-тСССШ^ОитОш mmCO^DD^DmUU^rnmmUmOmmmmmmOOm
. О ОО . О О
-Сы- СМ ШшЯ О » _ «
«« «м • •
aN
•ooeeeeoo с*»»оооо»соф««ооо ИММИ •• • • •• IMMMI со
Рис, 2. Аминокислотная последовательность фрагмента 87-136 и ¿-связи с участием протонов N11, СПН и С^Н (С®Н2-протоны остатка пролина рассматривались как ЫН-протон). Использовано однобуквенное обозначение аминокислотных остатков, X - остаток норлейцина. Цифры соответствуют номеру остатка в аминокислотной последовательности БР. Толщина линий, отвечающих ¿-связям, характеризует интенсивности (сильные, средние и слабые) соответствую щих кросс-пиков в спектрах МЮЕЗУ (тт = 100 мс). Кружками отмечены ¿/-связи, не идентифицированные однознач) из-за перекрывания сигналов в спектрах. Остатки с промежуточными (< 10 ч) и замедленными (> 10 ч) временами полуобмена амидных протонов на дейтерий отмечены соответственно светлыми и черными кружками в строке Н —
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.