БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2015, том 32, № 3, с. 194-201
УДК 576.32/.36
ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННОЙ ПАТТЕРН ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ МЕХАНОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ СЕМЕЙСТВА TRP В РАННЕМ РАЗВИТИИ Xenopus tropicalis
© 2015 г. С. Г. Силина1, Д. А. Никишин12, С. В. Кремнёв1*
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119234, Москва, Ленинские горы, 1;
*электронная почта: s.kremnyov@gmail.com 2Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова, 26
Поступила в редакцию 19.01.2015 г.
Известно, что эндогенные механические напряжения в тканях развивающихся организмов участвуют в регуляции морфогенеза и дифференцировки. Эти процессы могут регулироваться биоэлектрическими сигналами. Структурами, которые переводят механический стимул в биоэлектрический сигнал, являются механочувствительные ионные каналы. Проведен экспрессионный анализ меха-ночувствительных ионных каналов семейства TRP в раннем развитии Xenopus tropicalis. Методами ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени показана пространственно-временная экспрессия мРНК ме-ханочувствительных ионных каналов семейства TRP в раннем развитии X. tropicalis.
Ключевые слова: механочувствительные ионные каналы, TRP-каналы, Xenopus tropicalis, раннее развитие.
Б01: 10.7868/80233475515030093
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время большой интерес вызывает участие механических факторов в таких фундаментальных процессах, как движение клеток, морфогенез и выбор направления клеточной дифференцировки [1—3]. Стало очевидным, что процессы формообразования и экспрессии генов регулируются не только биохимическими, но и механическими сигналами [4, 5].
Движение клеток, изменение механических характеристик тканей и клеточной адгезии в каждый момент времени формируют в развивающемся зародыше поля механических напряжений, которые, в свою очередь, определяют морфогенети-ческие движения клеток и тканей в последующий период развития [6]. Показано, что механические напряжения регулируют важнейшие морфогене-тические процессы раннего развития амфибий, такие как эпиболия, радиальная и планарная ин-теркаляция и апикальные сокращения клеток [2].
Каждая стадия развития характеризуется уникальным пространственным распределением механических напряжений [7]. Изменение поля механических сил, присущего данной стадии развития, драматически сказывается на формообразовании и дифференцировке осевых органов: нервной системы, хорды и сомитов [8]. Механические напряжения интегрируют клеточный и тканевой уровни
организации: при изменении механических натяжений клетки претерпевают пассивные деформации и активно изменяют форму, создавая новые напряжения на уровне ткани.
На зародышах амфибии Xenopus laevis, получены данные, свидетельствующие о том, что ионные токи и определяемый ими трансмембранный потенциал участвуют в регуляции транскрипции при формировании головных хрящевых структур и глаз [9, 10]. Поскольку механочувствительные ионные каналы являются структурами, переводящими механический стимул в ионный ответ, возможно, что именно они участвуют в регуляции механозависимых процессов в раннем эмбриональном развитии.
В представленной работе изучена экспрессия механочувствительных ионных каналов семейства TRP (transient receptor potential) в эмбриогенезе шпорцевой лягушки X. tropicalis. Большинство членов данного семейства неселективных ионных каналов участвуют в восприятии механических стимулов. Это семейство содержит наибольшее число каналов, которые участвуют в восприятии механических стимулов [11]. Практически все TRP-каналы экспрессируются в нервной системе позвоночных, а также могут участвовать в восприятии механических воздействий, холода, тепла, pH среды или химических факторов. На
основе анализа научной литературы были выявлены ионные каналы семейства TRP, способные активироваться в ответ на механический стимул, что, в свою очередь, приводит к регуляции морфогенеза или дифференцировки [11—15]. На сегодняшний момент известно, что механочувстви-тельностью обладают следующие каналы семейства TRP: TRPC1, -3, -5, -6, TRPV1, -2, -4, TRPM4, -7, TRPP2 (PKD2) и TRPA1, хотя для некоторых из них это еще не доказано окончательно [11, 12]. Каналы могут активироваться в ответ на механический стимул разными способами [16— 23]. Канал может открываться непосредственно при растяжении липидного бислоя мембраны клетки. Другие каналы взаимодействуют со структурными белками, например F-актином, и открываются в ответ на приложение механической силы к ним. Третья группа белков — это каналы, которые служат мишенями механочувстви-тельных сигнальных каскадов. Таким образом, для нас наиболее интересны механочувствитель-ные каналы, которые экспрессируются на ранних стадиях развития и поэтому могут участвовать в морфогенезе или клеточной дифференцировке.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Зародыши X. tropicalis получали и культивировали стандартными методами [24]. Суммарную РНК выделяли с помощью TRI Reagent (Sigma, США) и обрабатывали ДНКазой I (Fermentas, США) по протоколам фирм производителей. Концентрацию РНК измеряли на спектрофотометре Nano-drop 2000 (Thermo Scientific, США). Реакцию обратной транскрипции проводили на 2 мкг РНК с помощью набора MMLV RT kit (Евроген, Россия) в 25 мкл реакционной смеси. ПЦР проводили на амплификаторе MJ Mini (BIO RAD, США) с использованием 1 мкл кДНК, 10 пмоль специфических олигонуклеотидов (Литех, Россия) и набора HS TaqDNA Polymerase dNTP mix (Евроген Россия). Параметры амплификации: денатурация 30 с при 95°C, отжиг 30 с при 55—60°C, элонгация 30 с при 72°C, 30 циклов. Продукты амплификации анализировали с помощью агарозного гель-электрофореза и системы регистрации Gel Doc XR (BIO-RAD, США). Для исключения ложно-положительного результата использовали отрицательные контроли — ПЦР без матрицы и ПЦР без обратной транскрипции. В качестве положительного контроля использовали ген "домашнего хозяйства" — орнитиндекарбоксилазы (ODC).
ПЦР в реальном времени проводили на приборе Applied Biosystems 7500 с использованием набора qPCRmix-HS SYBR+LowROX (Евроген, Россия). Накопление продукта ПЦР регистрировали по флуоресценции интеркалирующего красителя SYBR Green I в присутствии референсного красителя ROX (30 нМ). Уровень относительной
экспрессии генов в контрольных и экспериментальных образцах рассчитывали методом ddCt
[25], данные нормировали по экспрессии гена ODC. Эффективность праймеров вычисляли методом линейной регрессии по абсолютной флуоресценции в период экспоненциального роста
[26]. Каждый эксперимент проводили в трех по-вторностях.
Специфические олигонуклеотиды подбирали в программе Lasergene PrimerSelect (DNAstar, США). Список праймеров и идентификационные номера нуклеотидных последовательностей генов в NCBI приведены в таблице.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Методом обратной транскрипции с последующей ПЦР (ОТ-ПЦР) нами проанализирован паттерн экспрессии механочувствительных ионных каналов на последовательных стадиях развития эмбриона X. tropicalis. В качестве внутреннего контроля использовали ген ODC. ОТ-ПЦР проводили на суммарной РНК, выделенной из неопло-дотворенных ооцитов и эмбрионов на стадиях дробления (стадии 4—6), средней бластулы (стадия 8), поздней бластулы (стадия 9), ранней га-струлы (стадия 10), нейрулы (стадия 16) и вылуп-ления (стадия 33). В качестве положительного контроля использовали пробы головастиков (стадии 42—43). Стадии определяли по таблицам нормального развития [27]. Результаты представлены на рис. 1. Показано, что TRPV2, TRPC3, TRPC5не экспрессируются на ранних стадиях развития X. tropicalis. Экспрессия генов этих каналов впервые выявляется на стадии нейрулы. На ранних стадиях развития экспрессируются гены следующих каналов семейства TRP: TRPV1, TRPV4, TRPM4, TRPM7, TRPC1, TRPC6, TRPA1 и PKD2. Следует отметить, что PKD2 часто формирует ме-ханочувствительный комплекс с PKD1 [28], который по нашим данным также экспрессируется на всех проверенных стадиях развития, начиная с ооцита (рис. 1). Однако PKD1 из-за его небольшого сходства с каналами TRP к этому семейству не относят [11].
С помощью ПЦР в реальном времени мы количественно описали пространственно-временной паттерн экспрессии каналов, выявленных на ранних стадиях развития. Сначала мы оценили относительный уровень экспрессии гена каждого канала в ооците по уровню экспрессии гена ODC. Оказалось, что различия в относительном количестве транскриптов очень высоки (рис. 2). Количество мРНК генов PKD2 и TRPM7всего в 10 раз меньше, чем ODC, тогда как в случае других генов (TRPC1, TRPC6) это различие достигает 100 000 раз. По количеству транскриптов гены механочув-ствительных каналов семейства TRP, экспресси-рующиеся в ооците, можно расположить следую-
Последовательности праймеров и идентификационные номера нуклеотидных последовательностей генов в базе NCBI
Ген Идентификационный номер Нуклеотидная последовательность праймера (5'—>3')
ОБС NM _001005441 геу GCCGTTTGTCCGAGGTGGTCTT GCTCTGCGCTGTTCTGCTGTTTGTA
ТВ.РУ1 хм_ 002938253 геу GCCGGTGCATTCCTCCCTCTAT TGGCGATTCGGCGTCTCACT
ТВ.РУ2 хм_ 002938256 геу TGCTGCGCTTCCTCTTTGTCTACCT CTCCGTTCCATTTGCTGCTTCCTG
ТКРУ4 хм_ 002932083 геу TGAGAGGCGCTGCAAACATTA GCAGGCCGCAAGGGAAAGAG
ТЯРС1 хм_ 002937099 геу TTGGCCAGTCCTCTCCGTGTG GCCCCATGGTGTTCTTCTTATCCTC
ТКРС3 хм_ 002941893 геу CACGCTGCCACCTGAAATAGAATA AATGCGTGAGAAGCTGAGAACAACT
ТКРС5 хм_ 002938783 геу TTGGGGTGAAATAAAGGAGATGTGG AAGGGAGATGGTTGCAAGGTAGAGG
ТЯРС6 хм_ 002935570 геу TGAGCCAGTGTGAGCCCTATGTGTC CGGCCCTTTTCTCGGAGTATTGTTT
ТКРМ4 хм_ 002943951 геу ATTTGCAGTCGGGCTCATTTGTAGG CTTGGGACCGAGAACTTTGCTGACT
ТЯРМ7 хм_ 002939628 геу TGATTGATGTGGGACTTGTTATTGA GCTGTGCTGTTTTGATGAAGTGATT
ТЯРА1 NM _001127962 геу TCATCCCTGTCCCTTATCGCTCTAT CGGACACGGCAAACATTACCC
РКБ1 хм_ 002932471 геу TTCCTCTAAATGACACCCGACCTG AACGATGATAGTGGCCACCGAGTAG
РКБ2 СЯ942526 геу TCGACAAGGTGGTGGGAAGT TCATGGGGCGAGGTAGAGAT
щим образом: РКБ2 > ТЯРМ7 > ТЯРУ4 > ТЯРМ4 > > ТЯРУ1 > ТЯРА1 > ТЯРС1 > ТЯРС6.
Следующим шагом стало количественное определение временного паттерна экспрессии каналов, выявленных на ранних стадиях развития. Были выявлены два типа паттерна (рис. 3). Перв
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.