НЕИРОХИМИЯ, 2012, том 29, № 3, с. 261-264
КРАТКИЕ ^^^^^^^^^^^^^^ СООБЩЕНИЯ
УДК 577.25
ПРОТЕАСОМА МОЖЕТ РАСЩЕПЛЯТЬ СУБСТРАТ КАСПАЗЫ-3
© 2012 г. А. А. Яковлев1,2, *, А. Ю. Гороховатский3, Ю. А. Тризна2, И. П. Белецкий2, Н. В. Гуляева1
Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва, Россия
2Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, Россия 3Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии РАН,
Москва, Россия
С использованием ионообменной хроматографии и гель-фильтрации показано, что при кислых значениях рН субстрат каспазы-3 могут расщеплять несколько разных протеаз мозга. Ранее мы показали, что одним из этих ферментов является катепсин В. Результаты данной работы, полученные с помощью субстратного анализа и Вестерн блоттинга, свидетельствуют о том, что при кислых значениях рН способностью расщеплять субстрат каспазы-3 обладает протеасома.
Ключевые слова: протеазы, каспаза-3, мозг, протеасома.
Важную роль в реализации программы апопто-за в головном мозге играют протеолитические ферменты семейства каспаз [1]. Каспазы достаточно специфичны в распознавании субстратов и катализируют расщепление полипептидной цепи только после остатка аспарагиновой кислоты. Долгое время было принято считать, что субстратной специфичностью, сходной с каспазной, обладает лишь гранзим В — активатор каспаз [2]. Синтетический субстрат Ac-DEVD-AMC (N-ацетил-Асп-1лу-Вал-Асп-7-амино-4-метилкумарин) до сих пор считается очень специфичным для каспа-зы-3 и каспазы-7 [3], и принято полагать, что другие протеолитические ферменты, тем более не принадлежащие к семейству каспаз, не могут расщеплять этот субстрат с высвобождением флуоро-фора. Тем не менее мы ранее столкнулись с тем, что при значениях рН около 4 синтетический субстрат каспазы-3 Ac-DEVD-AMC расщепляет другая протеаза — катепсин В [4]. Важно отметить, что сами каспазы максимум своей активности проявляют при нейтральном значении рН [5]. Таким образом, активность катепсина В может дополнять активность каспазы-3 в клетках организма в условиях снижения рН, например при дефиците кислорода [6]. Однако оказалось, что катепсин В — не единственная протеаза, не принадлежащая к семейству каспаз, способная расщеплять субстрат каспазы-3 в кислых условиях: в данной работе мы показываем, что субстрат каспазы-3 в кислых условиях может расщеплять протеасома.
* Адресат для корреспонденции: 117485, Москва, ул. Бутлерова, 5а, e-mail: al_yakovlev@rambler.ru.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Подготовка образцов. Ткань головного мозга крыс Вистар гомогенизировали в гомогенизаторе типа Potter S (тефлон—стекло) в течение 1 мин при 1500 об/мин в пяти объемах 20 мМ HEPES рН 7.5, 10 мМ KCl, 1.5 мМ MgCl2, 0.5 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT Гомогенаты центрифугировали в течение 30 мин при 14000 g при 4°С и полученный суперна-тант использовали для биохимических исследований.
Определение концентрации белка. Образцы до концентрации белка 0.01—0.1 мг/мл. В лунку 96-луночного планшета вносили 100 мкл пробы и 150 мкл реактива Бредфорд (0.017% Кумасси G-250, 17% фосфорной кислоты, 18% этанола). Пробы инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин и считывали поглощение при 595 нм. Калибровочную прямую строили по БСА.
Ионообменная хроматография. Ионообменную хроматографию проводили на колонне Waters Protein-Pak DEAE5PW 0.75 х 7.5 см. Колонку уравновешивали в 20 мМ HEPES рН 7.5 (буфер А). Наносили 1 мл мозга и элюировали со скоростью 1 мл/мин градиентом 0—0.5 М NaCl в буфере А в 40 фракциях по 1 мл каждая.
Гель-фильтрация. Гель-фильтрацию проводили на колонне Sepharose 6B 1.6 х 75 см. Наносили 0.5 мл мозга и элюировали буфером А со скоростью 0.5 мл/мин. Собирали фракции по 7 мл, всего 25 фракций.
Определение активности протеаз. Пробы после хроматографии обессоливали на спин-колонках Biorad Micro Bio-Spin 6. Активность каспазы-3 определяли флуориметрическим методом. Биоло-
3000 2S00 2000 1S00 1000 soo 0
2000 1S00 1000 soo 0
1000 soo 600 400 200 0
S 9 13 14 17 21 22 23
Pw а
-- б к
- \ / в V^aA.
.................
so
2S -
20
2S -
20
1
а
б -
6 8 10 12 1416 18 2022 2426 28 30 32 34 36 38 40
Рис. 1. Активность протеаз, пмоль/мин/мг белка, во фракциях после ионообменной хроматографии, а — ВБУОазная активность при рН 4.5, б — ВБУОазная активность при рН 7.5, в — активность протеасомы. По оси абсцисс — номер фракции, условия хроматографии приведены в тексте.
гический образец инкубировали при 37°С в реакционном буфере (100 мМ MES рН 7.5 или 4.5, 10 мМ DTT, 1 мМ ЭДТА, 50 мкМ субстрат каспа-зы-3 Ac-DEVD-AMC) в двух параллельных пробах. Активность протеасомы определяли по активности ее химотрипсинового сайта. Биологический образец инкубировали при 37°С в реакционном буфере (50 мМ Tris рН 7.8, 10 мМ MgCl2, 2 мМ АТФ, 1 мМ DTT, 50 мкМ субстрат Suc-LLVY-AMC (N-сукцинил-Лей-Лей-Вал-Тир-7-амино-4-метилкумарин)). Флуоресценцию регистрировали в течение 60 мин на планшетном ри-дере Wallac 3 (Perkin-Elmer, США) при длинах волн возбуждения и эмиссии 380 и 440 нм соответственно. Калибровочную прямую строили по АМС. Активность протеаз выражали в пмоль/мин/мг белка.
Вестерн блоттинг. Образцы кипятили в течение 5 мин в буфере 50 мМ Tris рН 6.8, 2% SDS, 100 мМ DTT, 5% глицерин, 0.005% бромфеноло-вый синий. После охлаждения до комнатной температуры пробы центрифугировали и наносили на полиакриламидный гель, Т15С2.7. После электрофореза содержимое геля электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану "забивали" 2%-ным молоком, затем окрашивали антителами к каспазе-3 или к субъединице протеасомы альфа5 в разведении 1 : 1000 (обычное время инкубации — 16 ч), затем в течение 1 ч инкубировали со вторичными антителами, конъюги-рованными с пероксидазой. Регистрировали хе-милюминесценцию с помощью рентгеновской
Рис. 2. Вестерн блоттинг некоторых фракций после ионообменной хроматографии, а — окрашивание антителами к альфа5 субъединице протеасомы, б — окрашивание антителами к каспазе-3. Слева — маркеры молекулярной массы, кДа.
пленки. Проявленные рентгеновские пленки фотографировали.
Материалы. В работе были использованы ЭДТА, HEPES, дитиотреитол, Tris производства Sigma-Aldrich (США), Ac-DEVD-AMC, Suc-LLVY-AMC производства Biomol (США), антитела к субъединице протеасомы альфа5 PA1-1962 производства Pierce (США), антитела к каспазе-3 RB1197 производства NeoMarkers (США).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Расщепление DEVD при кислом и нейтральном рН, а также протеасомальная активность во фракциях после ионообменной хроматографии растворимых белков мозга представлены на рис. 1. Результаты хроматографического разделения свидетельствуют, что субстрат каспазы-3 при кислых рН могут расщеплять минимум две различные проте-азы (рис. 1а, фракция 8 и фракция 22). При этом один из пиков активности протеасомы по отношению к своему субстрату приходится как раз на фракцию 22 (рис. 1в). Данные Вестерн блоттинга показывают, что во фракции 22 содержится именно протеасома (рис. 2а). Интересно, что часть DEVDазной активности при кислом рН может быть связана с неизвестной изоформой каспазы-3, поскольку фракции 13 и 14 окрашиваются антителами на каспазу-3 (рис. 1а и 2б). Часть DEVDазной активности при кислом рН связана, как мы отмечали ранее, с катепсином В [4], и мы предполагаем, что это активность содержится во фракциях 8 и 9 (рис. 1а). Активность собственно каспазы-3 сосредоточена в основном во фракции 22; там же каспаза-3 выявляется иммунологически (рис. 1б и рис. 2б).
HEЙPOХИMИЯ том 29 № 3 2012
ПРОТЕАСОМА МОЖЕТ РАСЩЕПЛЯТЬ СУБСТРАТ КАСПАЗЫ-З
263
6000 5000 4000 3000 2000 1000 0
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
3000 2500 2000 1500 1000 500 0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25
Рис. 3. Активность протеаз, пмоль/мин/мг белка, во фракциях после гель-фильтрации, а — ВБУОазная активность при рН 4.5, б — ВБУОазная активность при рН 7.5, в — активность протеасомы. По оси абсцисс — номер фракции, условия хроматографии приведены в
Распределение кислой ОЕУОазной, нейтральной ЭЕУОазной и протеасомальной активностей во фракциях после гель-фильтрации представлено на рис. 3. Как и при ионообменной хроматографии, активность по отношению к субстрату кас-пазы-3 в кислых условиях проявляют несколько протеаз (рис. 3а, фракции 10 и 20). Во фракции 10 кроме кислой ЭЕ0Уазной активности есть и про-теасомная активность (рис. 3в). В этой же фракции по результатам Вестерн блоттинга находится про-теасома (рис. 4). Фракция 10 после гель-фильтрации содержит самые крупные молекулы, при калибровке в этой фракции выходит голубой декс-тран с мол. массой около 2000 кДа. Нативная протеасома, масса которой составляет около 2000 кДа, выходит именно в этой фракции.
ОБСУЖДЕНИЕ
Таким образом, в мозге, наряду с катепсином В [4] есть фермент, способный расщеплять субстрат каспазы-3 Ac-DEVD-AMC при значении рН 4.5. По результатам гель-фильтрации, этот фермент имеет массу больше мегадальтона. По результатам ионообменной хроматографии и гель-фильтрации, фракция с этим ферментом расщепляет субстрат протеасомы и окрашивается антителами к альфа5 субъединице протеасомы. Это дает основание сделать заключение, что протеасома обладает кислой DEDVазной активностью.
Протеасома — внутриклеточная структура, ответственная за регулируемый протеолиз, состоит из многих субъединиц и является одним из самых крупных белковых комплексов в природе [7]. Протеасома обладает несколькими типами про-теолитической активности: в зависимости от субстратной специфичности, трипсиноподобной, химотрипсиноподобной и постпептидилглутами-лгидролизирующей активностью, причем химот-рипсиновая выражена значительно сильнее [8]. Можно предположить, что "кислая" DEVDазная активность непосредственно связана с постпеп-тидилглутамилгидролизирующей активностью протеасомы в первую очередь потому, что обе активности предпочитают консенсунсную последовательность с кислой аминокислотой в положении Р1.
Полученные результаты, с учетом показанной нами ранее способности катепсина В расщепля
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.