ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА, 2013, том 39, № 5, с. 112-118
УДК 612.746; 577.29
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЙ СИГНАЛИНГ В СКЕЛЕТНОЙ МЫШЦЕ ЧЕЛОВЕКА ПРИ АЛКОГОЛЬНОЙ МИОПАТИИ
© 2013 г. Б. С. Шенкман1, Ю. Н. Ломоносова1, Е. А. Лысенко1, Ю. В. Казанцева2, О. Е. Зиновьева2, Н. Н. Яхно2
1ФГБУНГНЦРФ — Институт медико-биологических проблем РАН, Москва
2 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, Москва
Поступила в редакцию 11.04.2013 г.
Хроническая алкогольная миопатия — одно из наиболее тяжелых и распространенных проявлений хронической алкогольной интоксикации. При алкогольной миопатии наблюдается глубокая атрофия локомоторных мышц, затрагивающая, главным образом, волокна, экспрессирующие изофор-мы миозина II "быстрого" типа. В то же время, на ранней стадии заболевания не всегда наблюдается развитие атрофических изменений. В экспериментах на алкоголизированных крысах и при исследовании мышц пациентов ранее было показано поражение анаболических сигнальных путей и нарушение белкового синтеза в скелетных мышцах. В настоящей работе впервые были исследованы протеолитические сигнальные механизмы у больных алкогольной миопатией с различной выраженностью атрофии мышечных волокон. На ранних стадиях заболевания наблюдалось существенное увеличение экспрессии ^3-убиквитин-лигаз. Однако уровень убиквитинизации мышечных белков у обследованных не изменился, что можно связать с увеличением экспрессии белков теплового шока, обладающих защитным действием по отношению к мышечным белкам.
Ключевые слова: скелетная мышца, алкогольная интоксикация, алкоголь-индуцированное поражение мышц, атрофия мышечных волокон, протеолиз, £3-убиквитин-лигазы, белки теплового шока.
DOI: 10.7868/S0131164613050147
Алкоголь-индуцированное поражение мышц, часто именуемое алкогольной миопатией, является весьма распространенным компонентом алкогольного синдрома, вносящим существенный вклад в инвалидизацию пациентов, и плохо поддающимся коррекции. Это заболевание, как правило, характеризуется интенсивным развитием атрофии мышечных волокон, глубоким снижением работоспособности, мышечной слабостью и болями. Снижение работоспособности и мышечная слабость наблюдаются даже на ранних стадиях заболевания, когда атрофические изменения еще не выявляются. На более поздних стадиях заболевания атрофические изменения наиболее выражены для волокон второго "быстрого" типа [1], также, как и в случае старческой саркопении [2]. Кроме того, если для большинства атрофических состояний наряду со снижением интенсивности синтеза белка наблюдается интенсификация протеолити-ческих процессов [3—5], то алкоголь-индуциро-ванное поражение мышц является некоторым исключением из этого правила. Из многочисленных исследований коллектива C. Lang (см. обзор [6]),
проведенных на алкоголизированных крысах, на культурах миобластов и миотуб, следует, что основной причиной атрофических изменений скелетных мышц при хроническом злоупотреблении алкоголем является трудно обратимое поражение сигнальных систем, контролирующих синтез белка (комплекс тТ0ВС1/р70Б6К и 4Е-ВР) [7]. В наших исследованиях на биопробах, полученных от больных с хронической алкогольной интоксикацией, также было обнаружено глубокое поражение системы тТОЯС1/р70^бК и впервые было выявлено снижение содержания и уровня фосфорилиро-вания рибосомальной киназы р90Я$>К также участвующей в регуляции синтеза белка [8]. Что же касается регуляции протеолиза при этом заболевании, то здесь остается много неясных вопросов.
Одной из основных доминирующих систем протеолиза в мышце является сигнальный убик-витин-протеасомный механизм (рис. 1) (см. обзор [5]). Работа этого механизма состоит в том, что скорость-лимитирующие ферменты Е3-убиквитин-лигазы присоединяют к белку-мишени 4 молекулы убиквитина, что и является
Рис. 1. Схема убиквитин-протеасомного механизма (цит. по [9]).
иЬ — убиквитин; Е1-иВА — Е1-убиквитин-активирующий фермент; Е2-иВС — Е2-убикивитин-конъюгирующий фермент; Е3-иВЬ — ЕЗ-убиквитинлигаза.
сигналом к переработке данного белка в комплексе 26^-протеасом.
В то же время у крыс-самцов хроническая алкоголизация не приводит к значимым изменениям показателей белковой деградации, включая экспрессию маркерных Е3-убиквитин-лигаз [10]. Однако такой феномен наблюдается не во всех случаях алкогольной интоксикации. Например, в эксперименте на крысах-самках в результате длительной алкоголизации было обнаружено увеличение экспрессии Е3-убиквитин-лигаз, ключевых ферментов убиквитин-протеасомного протео-литического механизма [11]. При однократной (острой) алкоголизации крыс показано увеличение экспрессии Е3-убиквитин-лигаз, после которого, однако не следовало соответственное увеличение накопления продуктов протеолиза [10]. Недавно обнаружено, что на начальных этапах алкоголизации у крыс-самцов наблюдается временная интенсификация экспрессии Е3- убикви-тин-лигазы MAFbx/atrogin-1 [12]. В то же время, эта убиквитин-лигаза не может считаться прямым маркером распада структурных и сократительных
белков. Ее субстратами являются сигнальные молекулы [13, 14].
Целью настоящего исследования являлась оценка работы убиквитин-протеасомной системы у больных с хроническим алкоголь-индуцирован-ным поражением мышц с разной выраженностью атрофических процессов (т.е. на разных стадиях патогенеза). Наша гипотеза состояла в том, что на начальной стадии развития заболевания повышается экспрессия убиквитин-лигаз, что может привести к активации защитных процессов, предотвращающих дальнейший распад структурных белков скелетных мышц.
МЕТОДИКА
Было обследовано 38 пациентов, находившихся на стационарном лечении в клинике нервных болезней Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. У всех больных был длительный алкогольный анамнез. Средняя продолжительность приема алкоголя составляла 16.2 лет, среднее количество потребляемого алкоголя — 185.5 мл/сут в пересчете на этанол.
114
ШЕНКМАН и др.
Критериями включения пациентов в исследование служили: возраст от 20 до 70 лет; длительность регулярного приема алкоголя не менее 3 лет в количестве не менее 100 мл этанола в сутки или наличие диагноза хронического алкоголизма.
Критериями исключения являлись: лекарственная или наркотическая зависимость; наследственные миодистрофии; другие причины развития миопатии (сахарный диабет, заболевания щитовидной железы, онкологические заболевания, почечная недостаточность, системные болезни соединительной ткани); инфекционные заболевания (в том числе вирусные гепатиты и ВИЧ-инфекция).
Взятие проб мышечной ткани из m. vastus lateralis осуществляли методом инцизионной биопсии. Кроме того были взяты пробы мышечной ткани у терх здоровых добровольцев с помощью игольчатой биопсии. Перед исследованиями пациенты и добровольцы подписывали информированное согласие на участие в клинико-лабораторных исследованиях. Проводимые исследования были одобрены Комиссией Первого МГМУ им. И.М. Сеченова по биомедицинской этике.
Иммуногистохимические процедуры. Пробы мышечной ткани немедленно замораживались в жидком азоте, затем хранились до анализа при —84°С. Поперечные срезы мышцы готовились на микро-томе-криостате (фирма Leica Microsystems, Германия) при температуре —20°С. Срезы инкубировались в течение 60 минут во влажной камере при температуре +37°С с первичными моноклональ-ными антителами против быстрых или медленных изоформ тяжелых цепей миозина NCL-MHCf и NCL-MHCs (Novocastra Laboratories, Великобритания) (разведение в PBS 1 : 30 для медленных и 1 : 40 для быстрых изоформ). Затем срезы промывались в PBS 3 раза по 5 минут. Добавлялись антитела козы против иммуноглобулинов мыши, конъюгиро-ванные с FITC (ИМТЕК, Россия), и инкубировались в течение 60 минут в темноте при комнатной температуре. Вторичные антитела отмывались в PBS 3 раза по 5 минут. Срезы фотографировались с помощью флуоресцентного микроскопа Leica Q500MC (Германия) и фотокамеры Leica DC300, средняя площадь поперечного сечения волокон измерялась с помощью программного обеспечения Leica Qwin. Анализировалось не менее 100 мышечных волокон.
Вестерн-блотинг. Замороженный образец мышечной ткани измельчался с помощью микрото-ма-криостата на срезы толщиной 20 микрометров, которые затем заливались холодным лизирующим буфером (Tris-HCl (pH = 8.0) 50 мМ; NaCl 150 мМ; SDS 0.1%; Triton Х-100 0.1%; EDTA 10 мМ; ß-glyc-erophosphat 50 мМ; EGTA 5 мМ; NaF 50 мМ; Na3VO4 1 мМ; Aprotinin 20 мкг/мл; Leupeptin 50 мкг/мл; Pep-statin 20 мкг/мл; PMSF 1 мМ). Образцы гомогени-
зировались на холоде с помощью гомогенизатора "Xenox" и откручивались в центрифуге с охлаждением в течение 10 мин при 10000 g (+4°C). Содержание белка в лизатах определялось с помощью бицинханинового метода. Предварительно готовилась смесь из 1 мл реагента А pH = 11.25 (0.1% бицинхониновая кислота; 2% Na2CO3; 0.95% NaHCO3; 0.16% калия-натрия тартрат тетрагидрат; 0.4% NaOH; H2O) и 80 мкл реагента В (1% CuSO4). К 1 мл приготовленной смеси добавлялось по 50 мкл предварительно разведенных проб, либо стандартов (бычий сывороточный альбумин). Пробирки тщательно перемешивались и инкубировались в термостате в течение 30 минут при 60°C. После инкубации пробирки охлаждались, оптическая плотность измерялась на спектрофотометре при длине волны 562 нм. Концентрация белка в пробах рассчитывалась по калибровочной кривой. Перед использованием лизаты смешивали с буфером Laemly (Tris-HClpH = 6.8 50 мМ; SDS2%; бромфеноловый синий 0.1%; глицерин 10%; H2O). Равное количество белка (10—20 мкг) наносилось в лунки для последующего разделения с помощью SDS-PAAG электрофореза (электрофорез в полиакриламидном геле). Белок переносился на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad). Мембрана инкубировалась в 5% растворе сухого обезжиренного молока.
После отмывки (3 раза по 5 минут в PBS-TWEEN) наносились предварительно разведенные в PBS-TWEEN первичные антитела против убиквитина.
После инкубации в первичных антителах мембрана отмывалась 3 раза по 5 минут в PBS-TWEEN, затем наносились вторичные антитела, коньюги-рованные с пероксидаз
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.