БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 3, с. 320 - 338
УДК 577.112.853
ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ N-ГЛИКОПРОТЕИНОВ СИНУСОИДАЛЬНОЙ ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ КРЫС С ПОМОЩЬЮ АФФИННОГО КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО АНАЛИЗА*
Обзор
© 2015 Джангли Ли1#, Джун Гао2#, Мяо Джианг1, Джи Чен1, Жонгуа Лиу1, Пинг Чен1,2**, Сонпинг Лианг1,2**
1 Ведущая лаборатория химии белка и биологии развития Министерства образования, Колледж наук о жизни, Юнаньский общий университет, Китайская народная республика, 410081 Чангша 2 Народный госпиталь Инаньского университета, Китайская народная республика, 511518Кингюань, провинция Гуандун; электронная почта: chenp@hunnu.edu.cn,
liangsp@hunnu.edu.cn
Поступила в редакцию 08.04.14 После доработки 03.11.14
Гликозилирование белков в клетках печени является одним из наиболее важных видов модификации белков. Гликозилирование белков играет важную роль во многих физиологических и патологических процессах, обусловленную их особым расположением на границе раздела между кровью и тканью, включая ангиогенез, рак, цирроз и фиброз печени. Чтобы проанализировать белки плазматической мембраны клеток синусоидального эндотелия печени (LSEC PM — liver sinusoidal endothelial cells, plasmatic membrane), N-гликопроте-ины, расположенные на поверхности LSEC PM, были сконцентрированы благодаря их аффинному связыванию с лектинами, находящимися на фильтрах, и затем были идентифицированы с помощью метода масс-спектрометрии. В целом было выявлено 225 уникальных сайтов N-гликозилирования в 152 гликопротеинах, из которых 119 (53%) сайтов были обнаружены впервые и ранее не определялись экспериментально. Среди идентифицированных гликопротеинов 53% белков были идентифицированы как белки плазматической мембраны и 47 гликопротеинов (31%) — как сигнальные белки и рецепторы. Кроме того, среди мембрано-связанных гликопротеинов LSEC PM было обнаружено 23 антигена кластера дифференциации (CD — cluster of differentiation) с 49 гликопептидами. Методами биоинформатического анализа было установлено, что большинство идентифицированных гликопротеинов оказывает влияние на процессы, происходящие в LSEC. Следовательно, N-гликопротеомный анализ LSEC PM может обеспечить получение необходимой информации, касающейся регенерации печени, и облегчить проведение диагностики заболеваний печени.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: эндотелиальная синусоидальная поверхность печени, N-гликопротеомный, N-глико-FASP, масс-спектрометрия.
Анализ белков плазматической мембраны и их посттрансляционной модификации является важным направлением в определении маркеров заболеваний и потенциальных мишеней для направленного действия лекарств [1]. Гликози-лирование белков является одним из основных
типов посттрансляционной модификации, оказывающей значительное влияние на сворачивание, изменения конформации, стабильность и активность белков. Подсчитано, что более половины всех белков млекопитающих находятся в гликозилированном состоянии [2]. Давно извест-
Принятые сокращения: LS EC — liver sinusoidal endothelial cells (клетки синусоидального эндотелия печени); PM — плазматическая мембрана; SPM — фракция плазматических мембран после центрифугирования в градиенте плотности сахарозы; NPM — фракция плазматических мембран после центрифугирования в градиенте плотности Nycodenz; ECM — extracellular matrix (внеклеточный матрикс); CD — cluster of differentiation (кластер дифференциации); LC—MS/MS — метод жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией; N-глико-FASP — метод захвата N-свя-занных гликопептидов, основанный на принципе FASP; KEGG — Kyoto encyclopedia of genes and genomes (энциклопедия генов и геномов Киото); TMD — трансмембранный домен; GRAVY — grand average hydropathy (средние значения гидропа-тии); CAM — cell adhesion molecule (молекулы клеточной адгезии); EGF — эпидермальный фактор роста; EGFR — рецептор эпидермального фактора роста; ПААГ — полиакриламидный гель.
* Приложение к статье опубликовано на сайте «Biochemistry» (Moscow), Vol. 80, issue 3, 2015.
** Адресат для корреспонденции.
# Авторы внесли равный вклад в работу.
но, что М-гликозилирование является наиболее распространенной формой модификации клеточной поверхности. Гликозилированию подвергаются остатки аспарагина, расположенные внутри консенсусной последовательности М-!Р-8/Г (где !Р означает любую аминокислоту за исключением пролина) [1]. Эта модификация задействована во многих функциях клеток, включая межклеточные и рецептор-лигандные взаимодействия, иммунный ответ, апоптоз и патогенез заболеваний [3]. М-гликозилирование преимущественно затрагивает мембранные белки, которые традиционно с трудом подвергаются анализу методами протеомики. Примечательно, что большинство белков млекопитающих в значительной степени гликозилированы [4]. Гликозилирование мембранных белков играет ключевую роль во многих биологических процессах, таких как адгезия клеток, их распознавание и передача сигнала внутрь клеток [5]. Нарушение процесса и изменение сайтов гликозили-рования являются основными признаками ко-генеза и развития опухолей. Значительное внимание в последнее время было уделено глико-протеомике, которая направлена на определение биологической роли гликозилирования белков и выявление связи гликозилирования с различными заболеваниями. В нескольких лабораториях для изучения гликопептидов и гликанов, прикрепленных к определенным сайтам глико-зилирования, были использованы масс-спект-рометрические методы. До настоящего времени для идентификации биомаркеров заболеваний интенсивные исследования выполнялись на биологических жидкостях, таких как плазма крови и слюна [5]. На протяжении многих лет изменения, происходящие в гликановых структурах сывороточных белков, являются признаком повреждений печени [6], и гликозилирование белков является объектом исследований при заболеваниях печени [5, 7]. Тем не менее вышло всего лишь несколько статей, посвященных изучению мембранных гликопротеинов клеток печени. Проведенный нами поиск по литературным источникам выявил только одну работу, посвященную изучению гликопротеинов мембран клеток печени у крыс. В работе Ли с соавт. основное внимание было сосредоточено на ха-рактеризации полного гликопротеома мембран клеток печени. Было выявлено 335 потенциальных сайтов М-связанного гликозилирования в 424 мембранных белках [8]. Как известно, печень состоит из различных типов клеток, включая Ь8БС, липоциты, Купферовские клетки, эпителиальные клетки желчного протока и ге-патоциты. Поэтому изучение мембран клеток печени представляет собой сложную задачу.
Клетки LSEC располагаются на границе между кровью и стенкой сосудов, а именно с люми-нальной стороны плазматической мембраны эндотелиальных клеток, и образованы одним слоем выровненных эндотелиальных клеток, выстилающих кровеносные сосуды, состояние которых имеет большое значение в различных физиологических и патологических процессах [9]. Масс-спектрометрический анализ мембранных белков затруднен из-за их гидрофобности. Плазматические мембраны LSEC составляют всего 15,2% от всех плазматических мембран печени. В настоящей работе было проведено концентрирование плазматических мембран. N-гли-копротеом этих мембран был проанализирован с помощью масс-спектрометрического анализа [8]. Недавние технологические усовершенствования методов приготовления образцов вместе с улучшением методов масс-спектрометрическо-го анализа облегчили проведение анализа этих белков и их посттрансляционных модификаций [1, 9, 10]. Метод приготовления образца с помощью фильтра (FASP — filter-aided sample preparation), при котором гликопептиды концентрируются при помощи опосредованной лек-тинами аффинной очистки на поверхности фильтра, хорошо подошел для этой цели. Большинство мембранных белков может быть эффективно солюбилизировано с поверхности фильтра додецилсульфатом натрия, который затем легко удаляется во время отмывки полученного препарата [1, 11—13]. В настоящей работе мы успешно применили метод концентрирования гликопептидов с использованием метода ^^^^^ASP для проведения анализа N-гли-копротеома синусоидальной поверхности печени. В целом было выявлено 225 сайтов N-глико-зилирования в 152 гликопротеинах. В это число вошли 23 CD-антигена, 49 гликопептидов было идентифицировано внутри мембранных гли-копротеинов LSEC. Многие из идентифицированных гликопротеинов, такие как CD 13, CD147, CD82, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR — epidermal growth factor receptor) и интегрин р-1, ассоциируются с физиологическими и патологическими процессами. Полученные данные могут послужить ключом для идентификации потенциальных молекулярных мишеней для действия лекарств и биомаркеров синусоидальной поверхности печени крыс.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Обзор аналитической стратегии, использованной в данной работе, проиллюстрирован на рис. S1 Приложения.
Метод пертурбации плотности мембран in vivo.
Уход за животными и все экспериментальные процедуры были осуществлены в соответствии с требованиями Правил и общих рекомендаций законодательства Китайской народной республики по работе с экспериментальными животными. Эта работа была одобрена местным комитетом по этике и выполнена в соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской декларации. Для выделения плазматических мембран LSEC был использован метод фракционирования на кремниевых наночастицах [14—16], за тем исключением, что этапы пертурбации плотности мембран in vivo были проведены согласно предыдущим нашим работам [16]. Схематическое представление этапов выделения мембран показано на рис. 1, a. Сначала крысы подвергались анестезии 10%-ным хлоралгидратом (n = 6). Перфузию печени проводили в коллоидной суспензии кремния и затем наслаивали полиакриловую кислоту. Процедуры пертурбации плотности мембран повторяли один раз, чтобы получить более плотные люми-нальные мембраны. После гомогенизации грубый препарат плазматических мембран LSEC (SPM) получали путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Плотность мембран превышала плотность 69%-ного раствора сахарозы. Затем полученные препараты мембран печени от пяти крыс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.