ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2013, том 449, № 2, с. 236-239
БИОФИЗИКА, БИОХИМИЯ, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.122
ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ МЕТИЛЖАСМОНАТА НА КОРНИ ПРОРОСТКОВ ГОРОХА © 2013 г. В. Г. Яковлева, А. М. Егорова, академик И. А. Тарчевский
Поступило 18.06.2012 г.
БО1: 10.7868/80869565213080288
Известно, что стрессовый фитогормон жасмоно-вая кислота является ключевым фактором индукции иммунитета растений против некротрофных патогенов и некоторых растительноядных насекомых. При инфицировании, действии элиситоров или повреждении тканей растений в них происходит быстрое накопление жасмоновой кислоты, что вызывает "включение" жасмонатзависимого сигнального пути и активацию синтеза ряда белков, принимающих участие в защитных реакциях растений. Сигнальными функциями обладает и производное жасмоновой кислоты метилжасмонат (МеЖ), который может транспортироваться по растению, вызывая системный иммунитет.
Наибольшая часть исследований влияния жас-монатов на набор и содержание белков у растений проведена на надземных органах [1], а не корнях, в то время как изменения протеомов под влиянием различных воздействий, например стрессовых фитогормонов, у этих органов могут сильно различаться [2, 3]. В литературе имеются ограниченные сведения о влиянии жасмонатов на протеомы корней риса [2, 4] и арабидопсиса [5].
Недавно было высказано мнение, что не у всех видов высших растений жасмонаты играют значительную роль в защите от патогенов. В опытах с горохом Pisum sativum L. было обнаружено, что в листьях и корнях гороха в оптимальных условиях произрастания растений, при инфицировании и обезвоживании отсутствуют продукты алленоксид-синтазной реакции оксофитодиеновая (ОФДК) и жасмоновая кислоты [6]. В условиях стресса происходило накопление не этих соединений, а различных продуктов гидропероксидлиазных реакций, в том числе антимикробных оксилипинов (азелаино-вая кислота и др.). Если растения гороха действительно относятся к "безжасмонатным", то можно было ожидать, что у них реакция протеомов на действие экзогенных жасмонатов отличается от таковой у растений других ("жасмонатных") видов.
В связи с этим, а также с ограниченностью данных о влиянии жасмонатов на протеомы кор-
Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской Академии наук
ней растений мы провели опыты по выявлению МеЖ-индуцируемых белков в корнях гороха. Так как известно, что МеЖ вызывает, наряду с индукцией иммунитета, торможение роста корней, то можно ожидать, что МеЖ приведет, с одной стороны, к синтезу защитных белков, с другой — к подавлению синтеза белков, связанных с активными ростовыми процессами. Для проверки этого предположения мы провели протеомные исследования корней восьмидневных проростков гороха, которые к этому сроку сформировали хорошо развитую корневую систему, состоящую из главного и 15—20 боковых корней. Проростки в возрасте восьми дней помещали в раствор МеЖ 20 мкМ на 3 сут. Извлечение растворимых белков корней проводили по методике, использовавшейся в предыдущей работе [7]. Одномерное разделение белков проводили с помощью градиентного 9-16%-го ДДС-ПАГ-электрофореза в трис-глициновом буфере по Лэммли [8].
Если судить по степени окрашивания белков на одномерных электрофореграммах с помощью кумасси G-250, то наблюдалось существенное повышение содержания белков в области полос 1, 2 и 3 (рис. 1). Для идентификации белков содержащие их полоски вырезали из геля и проводили трипсинолиз. Хроматографическое разделение проводили на системе наноВЭЖХ UltiMate 3000 ("Dionex", Нидерланды). Детектором служил тандемный квадрупольный масс-спектрометр MicrOTOF-Q ("Bruker Daltonics", Германия) c ионизацией в электроспрее. Спектры снимали в положительном режиме ионизации, обрабатывали с помощью программы DataAnalisys ("Bruker Daltonics", Германия). Поиск вели в базе данных NCBI (Национальный центр биотехнологической информации) с выборкой по таксону "зеленые растения". Идентифицированными считали те белки, у которых по крайней мере два пептида имели Score (достоверность поиска) выше 49 (p < 0.05).
Метилжасмонат вызывал существенное повышение содержания трех изоформ липоксигеназ (рис. 1, полоса 1; табл. 1), осуществляющих окси-генирование ненасыщенных жирных кислот, главным образом линоленовой кислоты. Извест-
ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ МЕТИЛЖАСМОНАТА
237
но, что в растениях основным депо ферментов синтеза жасмоновой кислоты из линоленовой (липоксигеназ, алленоксидсинтазы, алленоксид-циклазы) являются хлоропласты листьев. По всей вероятности, в корнях следствием МеЖ-индуци-рованного существенного повышения содержания липоксигеназ может быть активация других ветвей липоксигеназного метаболизма, продуктами которых являются различные антипатогенные оксилипины, но не ОФДК и жасмонаты.
В связи с этим отсутствие в корнях гороха окси-липинов — продуктов алленоксидсинтазной реакции [6] — представляется вполне закономерным. Обнаруженное в опытах этих авторов отсутствие ок-силипинов и в листьях гороха вызывает большой интерес в связи с тем, что в листьях гороха другими авторами была найдена экспрессия генов алленок-сидсинтазы, алленоксидциклазы и редуктазы 12-ок-софитодиеновой кислоты [9, 10]. Интенсивность экспрессии и накопления в тканях их транскриптов могла очень сильно изменяться под влиянием эли-ситоров, супрессоров и вирулентных патогенов.
Попытки идентификации низкомолекулярных белков в полосах геля 2 и 3 из образцов одномерного электрофореза не дали положительных результатов, поэтому для более полного разделения белков использовали двумерный электрофорез [7]. Пластины геля окрашивали кумасси G-250 (рис. 2), что позволяло количественно оценить содержание белков.
После окрашивания двумерных электрофоре-грамм было обнаружено около 600 белковых пятен. При воздействии МеЖ происходило изменение окраски 80 белковых пятен: в 30 пятнах окраска усиливалась, в 50 — уменьшалась. Гели анализировались с помощью программы Phoretix 2D v 2004 ("Nonlinear Dynamic", Великобритания). Для дальнейшей идентификации белков брали только те пятна, у которых кратность соотношения величин содержания белков в контрольном и опытном варианте была не ниже 2.
Идентификация МеЖ-зависимых белков была проведена на тандемном MALDI-TOF-TOF масс-спектрометре Ultraflex II "Bruker" (Германия), оснащенном УФ-лазером, точность измерения масс фрагментов составляла 1 Да. Белки идентифицировали с помощью программы Mascot (www.matrixscience.com). Поиск по "пептидному фингерпринту" проводили в базе данных NCBI. Белки, которые не определялись по "пептидному фингерпринту", определяли с помощью MS/MS-фрагментации пептидов. В поиске по MS/MS- и MS + MS/MS-результатам использовали программное обеспечение Biotools 3.0 ("Bruker Dal-tonics", Германия).
Нами была идентифицирована часть МеЖ-за-висимых белков (рис. 2, табл. 1). Наиболее существенные изменения протеома заключались в появлении двух изоформ ингибиторов протеаз (бел-
МеЖ
кДа
66
45
36
24
Рис. 1. Одномерный электрофорез растворимых белков корней гороха; К — контроль, МеЖ — 20 мкМ МеЖ. Слева — молекулярные массы белков маркёров в кДа, справа обозначены белковые полосы, которые анализировались. На гель наносилось 250 мкг белка.
ковые пятна 10, 11) и трипсинового ингибитора по типу Куница (белковое пятно 12). Известно, что ингибиторы протеаз играют ключевую роль в защите растений против патогенных микроорганизмов и некоторых растительноядных насекомых, экскретирующих протеазы для обеспечения своего аминокислотного питания за счет протео-лиза белков растения-хозяина. Значительное накопление ингибиторов протеаз под влиянием обработки растений МеЖ должно затруднить питание патогенов и ограничть их развитие.
Впервые в корнях был обнаружен в качестве МеЖ-индуцируемого дефенсинподобный белок (пятно № 6, табл. 1). По-видимому, он относится к семейству ранее выявленных в листьях жасмо-нат-индуцируемых дефенсинов [11] — маркёрных белков прямого антипатогенного действия, нарушающих функционирование клеточной мембраны патогенов и, вследствие этого, подавляющих их развитие.
Также впервые в качестве МеЖ-индуцируемо-го белка в корнях была идентифицирована про-фукозидаза (белок 8), содержание которой существенно повышалось при обработке корней МеЖ. Профукозидаза гидролизует фукозилированные
2
3
238 ЯКОВЛЕВА и др.
Таблица 1. Идентифицированные МеЖ-индуцированные растворимые белки корней гороха
Номер пятна Номер белка в NCBI Идентифицированные белки Вид растения MM/pI экспер.—теорет. Число пептидов Совпадения аминокислотной последовательности, % Достоверность поиска
1 T06827 Липоксигеназа Garden pea 97.0/6.10-97.3/6.08 14 19 375
2 Q9ZSQ2 Липоксигеназа Pisum sativum 97.0/6.18-55.8/5.87 8 17 309
ЬохШ
3 S56655 Липоксигеназа Garden pea 97.1/6.32-97.0/6.32 13 9 274
4 gi |92876874 5-метилтетрагидро- Medicago truncatula 84.2/6.20-84.2/5.97 17 20 99
птероилтриглюта-
матгомоцистеин-
$-метилтрансфераза
5 gi |62546341 Тубулин А Glycin max 56.6/5.38-49.7/4.99 11 25 104
6 gi |79320568 Дефенсинподоб- Arabidopsis thaliana 37.1/5.56-64.7/8.76 3 31 91
ный белок 279
7 gi |21190644 4 Фруктокиназа Gossypium hirsutum 36.3/5.35-35.0/5.28 6 14 74
8 gi |3650368 Профукозидаза Pisum sativum 21.0/5.98-23.6/6.16 5 29 166
9 gi119446612 7 Фруктокиназа Arachis hypogaea 36.2/5.40-20.0/5.07 8 35 76
10, 11 gi|20269067 Протеазный инги- Sesbania rostrata 22.1/5.07-23.5/5.81 4 15 105
битор 22.1/5.15-23.5/5.81
12 gi|75102445 Ингибитор Pisum sativum 20.7/5.34-23.8/5.28 5 17 127
трипсина типа
Куница
ксилоглюканы — гемицеллюлозные полисахариды первичных клеточных стенок растений, что может вызвать существенную модификацию последних и повлиять на интенсивность ростовых процессов. Дефукозилирование обычно образующихся при патогенезе ксилоглюкановых олигоса-харидов (олигосахаринов) может привести к потере ими свойств элиситоров, вызывающих у растений формирование иммунитета к патогенным микроорганизмам [12].
Наблюдалось также появление нового белкового пятна 9 (табл. 1), которое было иденти
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.