БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 4, с. 527 - 533
УДК 577.354.25
ПРОТЕОРОДОПСИН ИЗ Dokdonia sp. PRO95 -СВЕТОЗАВИСИМАЯ №-ПОМПА*
© 2015 Ю.В. Берцова, А.В. Богачев, В.П. Скулачев**
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва; факс: +7(495)939-0338, электронная почта: skulach@belozersky.msu.ru
Поступила в редакцию 23.11.14
Ген, кодирующий протеородопсин из Dokdonia sp. PRO95 (AEX55013), клонирован и экспрессирован в клетках Escherichia coli. Освещение протеородопсин-продуцирующих клеток E. coli в №+-содержащих средах вызывало защелачивание среды измерения, которое ускорялось в присутствии протонофора CCCP и инги-бировалось проникающим анионом SCN-. Освещение клеток в безнатриевой среде (при замене Na+ на K+) сопровождалось SCN^-стимулируемым и CCCP-чувствительным закислением среды. Освещение протео-родопсин-содержащих клеток E. coli приводило к CCCP-устойчивому трансмембранному транспорту ионов натрия из этих клеток. Таким образом, установлено, что протеородопсин из морской флавобактерии Dokdonia sp. PRO95 является первичной светозависимой натриевой помпой. Высокий уровень гетерологи-ческой продукции этого белка в клетках E. coli, а также стабильность и чистота выделяемых препаратов делают данный протеородопсин удобной моделью для изучения механизма активной трансмембранной транслокации ионов натрия.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: №+-транслоцирующий протеородопсин, трансмембранный транспорт натрия, фла-вобактерии.
Большинство бактерий используют А—н+ в качестве энергетической валюты при преобразовании энергии. Каталитическая активность различных комплексов дыхательных и фотосинтетических цепей, а также некоторых других энергопреобразующих мембранных ферментов сопряжена с трансмембранной транслокацией ионов H+. Образованный таким образом А—н+ далее используется для совершения различных видов работ.
Оказалось, что активность некоторых бактериальных белков сопряжена с трансмембранным переносом Na+, а не протона. Впервые это было показано в 1980 г. П. Димротом, который описал №+-транслоцирующую декарбоксилазу оксалоацетата из энтеробактерии Klebsiella aero-genes [1]. Впоследствии было установлено, что
Принятые сокращения: ДСН-ПААГ — электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия; CCCP — м-хлоркарбонилцианид фенилгидразон; DDM — и-додецил^-Б-мальтозид; R-E. coli — индуцированные в присутствии ретиналя клетки E. coli BL21/pRhod_10.1; ApH — трансмембранная разница значений pH; А—н+ — трансмембранная разница электрохимических потенциалов ионов Na+; А—н+ — трансмембранная разница электрохимических потенциалов ионов Na+; А^ — трансмембранная разница электрического потенциала.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM14-316, 15.02.2015.
** Адресат для корреспонденции.
все мембранные бактериальные декарбоксила-зы, декарбоксилирующие различные карбоно-вые кислоты, используют только в качестве сопрягающего иона [2]. В дальнейшем были открыты и другие первичные натриевые помпы прокариот — №+-транслоцирующая МАБИ:хи-нон-оксидоредуктаза [3, 4] и гомологичная ей Ма+-транслоцирующая МЛБИ:ферредоксин-оксидоредуктаза [5, 6], №+-транспортирующие метилтрансферазный комплекс [7] и формилме-танофуран-дегидрогеназа [8], №+-транслоци-рующие АТРазы (ЛТРсинтазы) [9, 10] и транспортирующие пирофосфатазы [11]. Образованный с помощью этих ферментов Л—И+ может быть далее использован для совершения основных видов работ — химической [10], осмотической [12] и механической [13], формируя, таким образом, натриевый цикл преобразования энергии [14].
При анализе геномов прокариот было обнаружено, что описанные выше №+-транспорти-рующие ферменты широко распространены среди бактерий и архей [15], особенно часто они встречаются у морских, патогенных и метано-генных микроорганизмов. Остается открытым вопрос, в чем состоит причина замены сопрягающего иона с И+ на у этих организмов? Высказывалось предположение о преимуществах натриевого цикла при росте бактерий при щелочных значениях рИ, а также в других усло-
виях, сопровождающихся пониженным уровнем А—Н+ [14]. Другим объяснением широкого распространения Ма+-транслоцирующих ферментов может быть представление о первичности использования натриевого цикла в ходе возникновения и эволюции мембранных энерго-преобразующих белков живых организмов [15].
Совсем недавно семейство первичных натриевых помп пополнилось еще одним представителем. Ранее считалось, что различные бакте-риородопсины могут функционировать в качестве светозависимых переносчиков ионов Н+ или С1-, а также служить рецепторами света [16]. Однако недавно было установлено, что один из протеородопсинов морской флавобактерии Krokinobacter eikastus способен к светозависимо-му переносу ионов из цитоплазмы во внешнюю среду [17]. В отсутствие ионов натрия этот белок переносит протоны в том же направлении, хотя и со значительно более низкой скоростью протекания фотоцикла [17]. По способности к переносу как иона натрия, так и протона, этот белок сходен с некоторыми №+-транс-лоцирующими АТРазами и пирофосфатазами [18]. Впоследствии Ма+-протеородопсин был описан и у другой морской флавобактерии — у Nonlabens marinus [19]. Анализ аминокислотных последовательностей Ма+ -протеородопсинов показывает, что они формируют обособленную филогенетическую группу среди всех известных ретиналь-связывающих белков [20].
Исследование Ма+-транслоцирующих ферментов имеет ряд преимуществ по сравнению с протонными помпами. Прежде всего, при изучении №+-помп можно свободно манипулировать концентрацией сопрягающего иона без существенного влияния на стабильность белка, что невозможно в случае Н+-транслоцирующих ферментов. В частности, можно исследовать каталитический цикл натрий-зависимого фермента при лимитировании его скорости низкими концентрациями и выявить в нем стадии, специфически ускоряющиеся этими ионами. Поэтому исследование Ма+-помпирующих про-теородопсинов важно не только для детализации натриевого цикла, но также способно привести и к существенному прогрессу в понимании механизма функционирования ретиналь-содержащих энергопреобразующих ферментов.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактериальные штаммы и условия выращивания. Культура Dokdonia 8р. РЯ095 была получена из коллекции микроорганизмов и клеточных культур института Лейбница (Б8М2). Клетки
выращивали при 25° в среде MM как описано в [21]. Клетки Escherichia coli растили при 37° в средах LB или TB. При необходимости в эти среды вносили ампициллин до конечной концентрации 125 мкг/мл.
Конструирование экспрессионного вектора, несущего ген, кодирующий протеородопсин AEX55013 из Dokdonia sp. PRO95 с С-терминальной гекса-гистидиновой последовательностью. Нуклеотид-ная последовательность, кодирующая протеородопсин AEX55013, была амплифицирована методом ПЦР с использованием высокоточной полимеразы «Tersus» («Евроген», Россия) и пары праймеров rhod_dir (5'-GCCATGGCACAAGAA-CTAGGA) и rhod_rev (5'-CGAGCTCCTATTTG-CTTCGACTAG), а также геномной ДНК Dokdonia sp. PRO95 в качестве матрицы. Амплифици-рованный 849 п.н. фрагмент был клонирован в вектор pBAD-TOPO™ («Invitrogen», США) с получением плазмиды pTopo_Rhod_10. Для удаления .N-концевой лидерной последовательности, добавляемой к клонированному гену экспрес-сионным вектором pBAD-TOPO, в соответствии с инструкцией производителя конструкция pTopo_Rhod_10 была обработана эндонук-леазой NcoI и после этого зашита с получением плазмиды pRhod_10.1. Правильность клонированной вставки была проверена секвенировани-ем. Полученная конструкция (pRhod_10.1) была трансформирована в клетки E. coli штамма BL21.
Выделение рекомбинантного протеородопсина. Для индукции синтеза протеородопсина клетки E. col//pRhod_10.1 сначала выращивали в среде TB до поздней логарифмической фазы роста (A600 ~1,5) при 37°, после чего в ростовую среду добавляли 1,5 г/л L-арабинозы и 1,5 мг/л пол-ностью-транс-ретиналя. Клетки далее выращивали при 15° в течение 16 ч [22], далее осаждали центрифугированием (10 000 g, 10 мин) и дважды промывали средой, содержащей 300 мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl и 5 мМ MgSO4, pH 8,0. Клеточный осадок суспендировали в среде A, содержащей 300 мМ KCl, 20 мМ Tris-HCl, 5 мМ MgSO4, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид и 5 мМ имидазол, pH 8,0. Полученную суспензию пропускали дважды через пресс Френча (16 000 psi). Неразрушенные клетки удаляли осаждением при 22 500 g (10 мин), супернатант центрифугировали при 200 000 g (75 мин). Полученный осадок мембран суспендировали в среде A, солюби-лизировали его в присутствии 1,5%-ного DDM и центрифугировали при 200 000 g (60 мин). Протеородопсин выделяли из полученного су-пернатанта с помощью аффинной хроматографии. Для этого супернатант наносили на колонку с сорбентом Ni-NTA, уравновешенным со средой Б, содержащей 300 мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl,
0,05%-ный DDM и 10 мМ имидазол, pH 8,0. Колонку промывали дважды, сначала средой Б, а далее этой же средой, содержащей 100 мМ имидазол. Сорбированный протеородопсин смывали с колонки средой Б, содержащей 250 мМ имидазол. Полученный белок концентрировали и хранили при —80°. Содержание белка определяли бицинхониновым методом [23], используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.
Светозависимый трансмембранный транспорт протонов в клетках E. coli. Индуцированные клетки E. colz/p Rhod_10.1 (R-E. coli) осаждали центрифугированием (10 000 g, 10 мин), дважды промывали средой, содержащей 100 мМ Na2SO4 (или K2SO4), 10 мМ Tris-HCl и 5 мМ MgSO4, pH 8,0, суспендировали в этой же среде и инкубировали анаэробно при 4° в течение 16 ч. Эта процедура приводила к истощению клеток по эндогенным субстратам и их загрузке нужным катионом (Na+ или K+). Истощенные клетки дважды промывали 100 мМ Na2SO4 (или K2SO4) и суспендировали в этом же растворе до концентрации клеточного белка 2 мг/мл. Полученную суспензию помещали в ячейку объемом 1,4 мл, оснащенную pH электродом. pH суспензии доводили до 7,0 добавлением раствора NaOH (или KOH). Ячейку с клетками инкубировали в темноте, после чего
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.