ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 2, с. 243-252
УДК 581.1
ПРОТИВОПОЛОЖНОЕ ВЛИЯНИЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ АУКСИНОВ -2,4-ДИХЛОРФЕНОКСИУКСУСНОЙ И 1-НАФТИЛУКСУСНОЙ КИСЛОТ НА РОСТ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ЖЕНЬШЕНЯ НАСТОЯЩЕГО
И СИНТЕЗ ГИНЗЕНОЗИДОВ
© 2007 г. И. Н. Смоленская, О. В. Решетняк, Ю. Н. Смирнова, Н. Д. Черняк, Е. Б. Глоба, А. М. Носов, А. В. Носов
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 19.07.2006 г.
Исследовали влияние синтетических ауксинов - 2,4-Д и НУК на рост суспензионной культуры клеток женьшеня настоящего (Panax ginseng C.A. Mey) и синтез гинзенозидов. С этой целью клеточную суспензию выращивали на средах, отличающихся составом гормональных добавок, в течение 6-8 последовательных пассажей. Культура клеток на всех средах с 2,4-Д в сочетании с цитокининами (БАП или кинетином), с гидролизатом казеина или без него демонстрировала стабильный рост. Средний индекс роста по сырой массе имел значение 5.16 ± 0.90, максимальный митотический индекс - 2%. Из популяции таких клеток, имеющих объем 10-17 х 104 мкм3, состоящей на 60-80% из 5-10-клеточных агрегатов с унимодальным распределением по количеству ядерной ДНК, легко выделялись протопласты. Суммарное содержание гинзенозидов в культуре клеток на средах с 2,4-Д в среднем составляло 0.18% от сухой массы. На средах с НУК, не зависимо от вида цитокинина и наличия гидролизата казеина, рост суспензии клеток замедлялся. Индекс роста по сырой массе в среднем был равен 2.15 ± 0.37, митотический индекс не превышал 0.13%. Клетки объемом 22-50 х 104 мкм3 формировали крупные агрегаты (>50 клеток), из которых не удавалось выделить протопласты. При культивировании с НУК в конце пассажа около 25% клеток имело удвоенное количество ядерной ДНК. Суммарное содержание гинзенозидов на средах с НУК в среднем составляло 4.46% от сухой массы клеток. Полученные результаты указывают на зависимость синтеза гинзенозидов от дифференцированности популяции клеток суспензионной культуры женьшеня настоящего. Определенный уровень цитодифференцировки в культуре клеток наблюдается в присутствии НУК, а 2,4-Д лишь поддерживает пролиферацию клеток in vitro.
Panax ginseng - ауксины - гинзенозиды - деление клеток - культура клеток - растяжение клеток -цитодифференцировка - эндоредупликация
ВВЕДЕНИЕ
Биосинтез изопреноидов играет важную роль в жизни растений. Основные классы терпеноидов представлены моно-, сескви-, ди- и тритерпенами. Последние демонстрируют широкий спектр, как химических структур, так и биологической активности [1]. Многие культивируемые in vitro клетки растений способны продуцировать разнообразные тритерпены на уровне интактных растений [2-4]. Женьшень настоящий - Panax ginseng C.A. Mey - знаменитое, редкое и медленно растущее лекарственное растение из рода Panax, синтезирует, по крайней мере, 30 различных тетрацикли-
Сокращение: CV - коэффициент вариации. Адрес для корреспонденции: Носов Александр Владимирович. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18; электронная почта: alex_n@ippras.ru
ческих (даммаранового типа) и пентацикличе-ских (олеананового типа) тритерпеновых глико-зидов - гинзенозидов. Основными активными компонентами женьшеня являются семь гинзенозидов даммаранового типа: Rbb Rb2, Rc, Rd (Rb-группа; агликон 20^)-протопанаксадиол) и Re, Rf, Rg1 (Rg-группа; агликон 20^)-протопанаксат-риол). Индивидуальные гинзенозиды проявляют различную фармакологическую активность, включая иммуномодулирующее, антистрессовое и противоопухолевое действие [5-7]. Сбор дикорастущих растений представляет большую угрозу для существования женьшеня в его естественных ареалах, а выращивание на плантациях - трудоемкий и длительный процесс, к тому же растения товарного возраста могут значительно варьировать по составу и количеству гинзенозидов.
Культивирование клеток и тканей женьшеня in vitro давно рассматривается в качестве альтернативы для производства его биомассы и получе-
243
6*
ния биоактивных гинзенозидов. Исследования культуры клеток женьшеня настоящего начались почти полвека назад [8, с. 153-154]. Для разных видов Panax в литературе накоплено много данных по содержанию гинзенозидов в клетках in vitro: от чрезвычайно высоких [9, 10] до средних, близких к нативному корню [11, 12], и низких значений [13, 14]. Такое варьирование данных может быть обусловлено несколькими причинами. Во-первых, ранее применявшиеся методы оценки количества гинзенозидов, основанные на колориметрии продуктов кислотного гидролиза смеси всех сапонинов клетки, могли значительно завышать значения в отличие от хроматографическо-го определения индивидуальных гинзенозидов. Во-вторых, существование клеток in vitro в течение десятков лет может привести к потере способности синтезировать вторичные соединения вследствие существенных изменений на уровне генома, которые наблюдаются при длительном культивировании [15]. В-третьих, важны биосинтетические характеристики исходного растения и эксплантов, давших начало популяциям культивируемых клеток.
Тем не менее, для повышения уровня синтеза гинзенозидов большое внимание уделяется оптимизации условий выращивания клеток in vitro, в том числе и составу питательных сред [16, 17]. Хорошо известно, что регуляторы роста и их соотношение - важнейшие факторы, определяющие возможность существования популяций изолированных клеток. Они оказывают влияние как на рост и дифференцировку, так и на специализированный метаболизм. Эффект определяется не только спецификой самого гормонального препарата, но также зависит от природы вторичных соединений, а подчас от вида растения и даже от штамма культивируемых клеток. В составе питательных сред наиболее часто используют два соединения с ауксиновой активностью (синтетические ауксины) - 2,4-Д и НУК. Эти гормональные препараты часто оказывают различное действие на синтез вторичных соединений. Так, синтез никотина в клетках табака стимулировала НУК, но тормозила 2,4-Д, а синтез антоцианов и нафтохи-нонов в культуре Plumbago zeylanica, наоборот, активировала 2,4-Д и тормозила НУК (цит. по [16]). До сих пор окончательно не выяснено влияние ауксинов на биосинтез гинзенозидов в культивируемых in vitro клетках разных видов женьшеня. Обычно для индукции каллусообразова-ния, получения активно растущей популяции клеток и дальнейшего ее культивирования наиболее часто используют сочетание 2,4-Д и кинетина [11, 17]. Давно было показано, что синтезу три-терпеновых сапонинов в каллусах P. ginseng способствовало присутствие в среде 2,4-Д в отличие от негативного эффекта ИУК [18]. В то же время 2,4-Д приводила к снижению содержания гинзе-
нозидов в суспензионной культуре клеток P. quin-quefolium [9].
Следует отметить, что хотя гинзенозиды синтезируются в культуре клеток, и эти соединения нельзя отнести к ряду метаболитов, продукция которых сопряжена с образованием дифференцированных надклеточных структур, в литературе встречаются единичные сведения, указывающие на то, что синтез гинзенозидов сопряжен с тканевой дифференцировкой [19, 20]. Более высокое содержание гинзенозидов удавалось получить в каллусах, формирующих корни и растущих на среде с НУК, в отличие от неморфогенных и мор-фогенных каллусов, культивируемых в присутствии 2,4-Д [20].
В нашей недавней работе на суспензионной культуре клеток P. japonicus было продемонстрировано, что популяцию клеток можно длительное время культивировать на среде с НУК и кине-тином с сохранением стабильного и достаточно высокого уровня синтеза гинзенозидов [12, 21]. Добавление 2,4-Д вызывало снижение общего количества гинзенозидов и изменение их спектра при глубинном выращивании [22]. Почти одновременно с суспензией клеток P. japonicus из кал-лусной культуры, производной корневых эксплантов P. ginseng с высоким содержанием гинзенозидов, была получена суспензионная культура клеток, которая несколько лет выращивается в коллекции на среде с 2,4-Д и БАП и содержит лишь следовые количества гинзенозидов [23].
Безусловно, существуют определенные штам-мовые и видовые различия (генетические и эпигенетические) в физиологическом ответе клеток на предлагаемые гормональные добавки, в том числе и на уровне синтеза тритерпеновых глико-зидов. Тем не менее, вероятное сходство путей регуляции биосинтеза гинзенозидов у видов Panax и представленные выше данные стимулировали нас к исследованию следующих аспектов: (1) способна ли смена состава фитогормонов активировать биосинтез гинзенозидов в полученной нами суспензионной культуре клеток P. ginseng; (2) существует ли зависимость между уровнем синтеза тритерпеновых гликозидов и цитофизиологическими характеристиками данной суспензии клеток.
МЕТОДИКА
Объект исследования. Суспензионная культура клеток Panax ginseng C.A. Mey (депонирована во Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений под № 66) была получена в 1998 г. из каллусной ткани, образованной на эксплантах 6-летнего плантационного корня с высоким содержанием гинзенозидов. Анализ экстрактов этого корня показал наличие семи основных гинзенозидов, суммарное содержание кото-
Варианты гормональных добавок и обозначения сред
Вариант Условное обозначение
2,4-Д, 2 мг/л; БАП, 0.5 мг/л Д1 (стандартная среда)
2,4-Д, 2 мг/л; БАП, 1.04 мг/л Д2
2,4-Д, 2.37 мг/л; БАП, 1.04 мг/л; гидролизат казеина, 500 мг/л Д3
2,4-Д, 2.37 мг/л; кинетин, 1 мг/л Д4
2,4-Д, 2.37 мг/л; кинетин, 1 мг/л; гидролизат казеина, 500 мг/л Д5
НУК, 2 мг/л; кинетин, 1 мг/л; гидролизат казеина, 500 мг/л Н1
НУК, 2 мг/л; кинетин, 1 мг/л Н2
НУК, 2 мг/л; БАП, 1.04 мг/л Н3
Примечание. Концентрация кинетина 1 мг/л эквимолярна 1.04 мг/л БАП; концентрация НУК 2 мг/л эквимолярна 2.37 мг/л 2,4-Д.
рых в разных его частях составляло от 6.6 до 13.3% от сухой массы [23]. Корень женьшеня был любезно предоставлен "Ginseng and Tobacco Company" (Корея). Суспензию клеток стандартно культивировали в жидкой питательной среде МС [24] с 0.1 мг/л тиамина, 0.1 мг/л пиридоксина, 0.5 мг/л никотиновой кислоты, 100 мг/л мезоино-зита, 0.5 мг/л БАП, 2 мг/л 2,4-Д и 3%-ной сах
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.