научная статья по теме ПСЕВДОВИРУСНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ ПРОТИВОВИРУСНЫХ СОЕДИНЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК-МИШЕНЕЙ Математика

Текст научной статьи на тему «ПСЕВДОВИРУСНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ ПРОТИВОВИРУСНЫХ СОЕДИНЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК-МИШЕНЕЙ»

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2010, том 435, № 1, с. 126-130

БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

УДК 2788

ПСЕВДОВИРУСНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ ПРОТИВОВИРУСНЫХ СОЕДИНЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК-МИШЕНЕЙ

© 2010 г. С. В. Чересиз, И. В. Григорьев, Е. А. Семёнова, В. О. Пустыльняк, академик В. В. Власов, А. Г. Покровский

Поступило 17.05.2010 г.

Псевдолентивирусы представляют собой ре-комбинантные вирусные препараты, по физиологии практически идентичные ВИЧ-1, но биологически безопасные. В данной работе предлагается описание модульной системы типа псевдовирус— клетка, разработанной для оценки активности ан-тиретровирусных соединений. Проверка эффективности применения этой системы для количественного описания ингибиторов репликации ВИЧ, проведенная на примере известных нуклео-зидных ингибиторов — азидотимидина (АЗТ) и его фосфоната — показала близкое соответствие получаемых данных опубликованным ранее, в связи с чем система может быть предложена для массового скрининга антивирусных препаратов.

ВВЕДЕНИЕ

Традиционной системой для оценки активности антиретровирусных препаратов служит модель острой вирусной инфекции, результатом использования которой стало открытие целого ряда препаратов для лечения ВИЧ-инфекции. Между тем этот подход имеет значительные недостатки: необходимость соблюдения специальных условий биобезопасности, сложность использования набора продуктивных штаммов ВИЧ, тропных к различным клеткам-мишеням, а также невозможность определения точной молекулярной мишени ингибитора. Последнее требует дополнительного исследования с применением изолиро-

Новосибирский государственный университет Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской Академии наук, Новосибирск

Научно-исследовательский институт терапии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, Новосибирск Институт химической биологии и фундаментальной медицины

Сибирского отделения Российской Академии наук, Новосибирск

ванных вирусных ферментов. Кроме того, эта модель неприменима для тестирования препаратов класса предшественников ингибиторов ВИЧ (prodrugs), требующих для активации работы систем клеточных ферментов.

Применение систем типа псевдовирус-клетка-мишень с использованием пермиссивных к инфекции индикаторных клеток и близких к естественным мишеням ВИЧ клеток T-лимфоидных и моноцитарных линий решает задачи массового скрининга и последующего детального описания ингибиторов ВИЧ. В отличие от ингибирования вирусных ферментов, модель псевдовирусной инфекции подходит для описания ингибиторов двойного действия, способных блокировать сразу несколько стадий репликационного цикла вируса.

Псевдолентивирусы получают экспрессией лен-тивирусного генома в эукариотических клетках-продуцентах. Многоплазмидная система лентиви-русной экспрессии была впервые описана L. Naldini с соавт. в 1996 г. для получения лентивирусного препарата, способного к трансдукции клеток in vitro и in vivo [1]. Псевдолентивирусы воспроизводят репликацию ВИЧ до стадии интеграции и экспрессии провируса, но вероятность появления вирусного потомства в зараженных клетках крайне низка — отсюда их второе название — "вирусы одного цикла инфекции". Это свойство, обусловленное разнесением частей вирусного генома на разные плазмиды, делает применение псевдовирусов для изучения антивирусных препаратов более безопасным и недорогим, чем использование инфекционных изолятов ВИЧ-1.

Системы псевдовирус—клетка состоят из двух модулей: клеток-продуцентов, экспрессирующих лентивирусный геном и воспроизводящих большую часть пост-интеграционнных событий ре-пликационного цикла, и клеток-мишеней, в которых происходят события инфекционной фазы цикла (рис. 1).

В данной работе мы предлагаем вариант системы для определения активности ингибиторов ВИЧ-инфекции, сочетающий в себе преимуще-

ПСЕВДОВИРУСНАЯ СИСТЕМА

127

EF1

U3 R Э RRE promotor CPPT IRES 1 eGFP

Векторная плазмида pWP1

CMV Gag -«.Tat» PolyA

Pol 1

Упаковочная плазмида pPAX2

ИНТЕГРАЗА^ встраивание " провируса в хромосому клетки

ВИРУСНЫИ поверхностный белок

связывание с клеточными рецепторами и ^ ^ вход вируса в клетку-мишень

протеолитическое созревание вириона ^"

Ф Ф Ф

/

^ Сбор вирусного препарата

, - " ОБРАЗОВАНИЕ ВИРУСА В

' КЛЕТКАХ-ПРОДУЦЕНТАХ

Специфические ингибиторы вирусной экспрессии Ингибиторы входа/слияния

(?1РНК, shРНК, антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы)

Зрелый вирус

ВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ В КЛЕТКАХ-МИШЕНЯХ

Ингибиторы сборки вируса Ингибиторы вирусной протеазы

Ингибиторы обратной транскриптазы Ингибиторы интегразы

Рис. 1. Схема применения модульной системы псевдовирус—клетка для тестирования ингибиторов различных классов.

WPRE

RU5

ства использования рекомбинантных псевдолен-тивирусов и метода проточной цитометрии. Последний обеспечивает высокую чувствительность регистрации флуоресценции зеленого флуоресцентного белка (еОБР), закодированного в последовательности векторного трансгена, и служит мерой эффективности инфекции. Предлагаемая система была использована для описания двух изученных ингибиторов обратной транскриптазы — азидотимидина (АЗТ) и его фосфоната.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные линии. В качестве клеток-продуцентов псевдолентивирусов и модельных клеток-мишеней использовали клеточную линию 29 3Т. Клетки линий MT-4 (Т-лимфоциты) и U937 (моноциты/макрофаги) использовали в качестве мишеней, близких к естественным мишеням ВИЧ-1.

Плазмиды. Плазмиды системы экспрессии лентивирусного генома были предоставлены проф. S. Brown (Лозанна, Швейцария). Векторная плазмида pWPI представляет собой лентивек-

Относительное ингибирование инфекции

Рис. 2. Ингибирование инфекции псевдотипирован-ным лентивирусом (ШУ/У8У-0) в клетках линий азидотимидином (1) и его производным — фосфона-том азидотимидина (2). а — 293Т (модельная линия клеток-мишеней, эмбриональный почечный эпителий человека); б — и937 (моноцитарно-макрофагаль-ная линия клеток человека); в — МТ-4 (Т-лимфоид-ная линия). При ингибировании инфекции в моно-цитарной линии (рис. 2б) при концентрациях ингибитора выше 100 мкМ начинается массовая гибель клеток, не позволяющая оценить параметры ин-гибирования при более высоких концентрациях.

тор, несуший репортерный ген eGFP. Упаковочная плазмида psPAX2 кодирует структурные белки и ферменты лентивирусной частицы и некоторые из регуляторных и вспомогательных вирусных белков. Плазмида pMD2.G кодирует поверхностный белок вируса везикулярного стоматита. Детальное описание и карты плазмид можно найти на сайте лаборатории Д. Троно (http://tronolab.epfl.ch/).

Получение псевдолентивирусных препаратов. Псевдовирусы получали методом кальций-фосфатной трансфекции плазмид системы экспрессии лентивирусного генома в клетки линии 293Т, очищали и концентрировали ультрацентрифугированием, как описано ранее [2].

Инфекция клеток-мишеней псевдолентивирусами. Клетки-мишени линии 293Т заражали при плотности клеточного монослоя ~70% методом центрифугирования—осаждения вируса. Клетки линий MT-4 и U937 предобрабатывали протаминсульфатом и заражали вирусным препаратом с добавлением про-таминсульфата, как описано ранее [3].

Степень инфекции определяли как долю GFP-экспрессирующих клеток, детектированных методом проточной цитометрии с помощью прибора BD Contu на третий день инфекции.

Ингибирование лентивирусной инфекции АЗТ и фосфонатом АЗТ. Величины ингибирования определяли в диапазоне концентраций от 1 нМ до 1 мМ, необходимое количество ингибитора добавляли в ростовую среду в момент инфекции клеток-мишеней. Степень подавления инфекции определяли как отношение количества GFP-экс-прессирующих клеток в экспериментах с ингиби-рованием и без него.

Обработка результатов. Статистическую обработку проводили с помощью программного пакета SigmaPlot 9.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Псевдолентивирусный препарат с титром >106 инфекционных единиц/мл использовался для моделирования инфекции в клетках различных типов - линий 293T, MT-4 и U937.

Ингибирование инфекции в клетках линии 293T. Клетки линии 293T были выбраны в качестве модельных мишеней в связи с простотой их инфицирования в клеточном монослое. Для заражения было подобрано разведение вируса, соответствующее значению плотности инфекции MOI (Multiplicity of Infection) ~0.8-0.9, т.е. 80-90% GFP-экспрессирующих клеток в отсутствие ингибирования. Количественные характеристики подавления инфекции АЗТ и его фосфонатом (кривые ингибирования) приводятся на рис. 2а и в табл. 1.

Ингибирование инфекции в клетках линий MT-4 и U937. Естественными мишенями ВИЧ-1 являются T-лимфоциты и макрофаги. Мы провели се-

ПСЕВДОВИРУСНЛЯ СИСTЕMA 129

Таблица 1. Сравнение активностей нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ в разных типах клеток

Тип клеток/условия эксперимента Концентрация 50%-ного ингибирования (IC50, (опубликованные данные), mkM Концентрация 50%-ного ингибирования (IC50, (наши данные), mkM Ссылки

A3T фосфонат A3T фосфонат

Модельные клетки-мишени 293Т, НеЬа Р4/Я5)/однократная репликация 0.04-0.2 - 0.8 5 [6], [7]

Лимфоидные клетки (линия МТ-2, первичные культуры лимфоцитов)/много-кратная репликация 0.01-0.2 0.01-0.1 [4], [7], [8]

Лимфоидные клетки (линия МТ-4)/одно-кратная репликация - - 5 40

Первичные моноциты/макрофаги/многократные циклы репликации 0.01 0.2 - - [4]

Моноцитарная линия И937/однократная репликация ~100 ~100

рию экспериментов для определения противовирусной активности АЗТ и его фосфоната в клетках линий MT-4 и U937. Применявшийся нами метод инфекции позволил добиться уровней инфекции, равных 100 и 50% в клетках MT-4 и U937 соответственно. Количественные характеристики инги-бирования АЗТ и его фосфонатом в клетках этих линий приводятся на рис. 2б, в и в табл. 1.

ОБСУЖДЕНИЕ

Описанное в литературе соотношение активностей АЗТ и его фосфоната (эффективные концентрации первого на порядок ниже, чем второго) в нашей работе наблюдалось для клеток линий 293T и MT4, тогда как в клетках U937 оба препарата обладали сравнимой ингибирующей активностью.

Поскольку активность ингибитора зависит от типа клеток-ми

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Математика»