УДК 577.3
ПУРИНЕРГИЧЕСКАЯ СИГНАЛИЗАЦИЯ В МЕЗЕНХИМНЫХ
СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ
© 2015 г. П. Д. Котова1, Ю. И. Фадеева2, О. А. Рогачевская1, В. Ю. Сысоева2,
В. А. Ткачук2, С. С. Колесников1*
Институт биофизики клетки РАН, 142290, Московская обл., Пущино, Институтская ул., 3; *электронная почта: staskolesnikov@yahoo.com 2Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119192, Москва, Ломоносовский просп., 27, корп. 1 Поступила в редакцию 09.04.2015 г.
Внеклеточный АТР является первичным медиатором, вовлеченным в межклеточные коммуникации и паракринные и аутокринные регуляции в самых разнообразных клеточных системах. Нами показано, что АТР и другие агонисты пуринорецепторов (ADP, UTP, UDP, BzATP) стимулируют Са2+-сигнализацию в мезенхимных стромальных клетках (МСК), выделенных из жировой ткани человека. Спектр эффективных агонистов, ингибиторный анализ и несущественное влияние наружного Са2+ свидетельствовали о ключевой роли Р2У-рецепторов, сопряженных с фосфоинози-тидным каскадом, в пуринергической трансдукции. Специфической особенностью пуринергиче-ских МСК было то, что ответы на агонисты пуринорецепторов генерировались по принципу "все или ничего". В определенной области концентраций агонисты были неэффективны, в то время как при превышении порога наблюдались Са2+-ответы практически неизменной, фактически максимальной амплитуды. С помощью фоточувствительного Са2+-хелатора NP-EGTA установлено, что в пуринергических МСК функционирует механизм Са2+-индуцированного выброса депонированного кальция (CICR), который, видимо, является основным механизмом усиления в каскаде трансдукции АТР и других агонистов. В частности, показано, что скачкообразное повышение концентрации внутриклеточного Са2+ путем фотолиза NP-EGTA вызывало генерацию ATP-подобных Са2+-ответов со сходной фармакологией. Предложена модель, в соответствии с которой ATP и другие агонисты P2Y-рецепторов стимулируют в МСК классический фосфоинозитидный каскад, что приводит к агонист-зависимому выбросу Са2+ из депо. Этот первоначальный Са2+-сигнал затем усиливается по механизму CICR до глобального Са2+-сигнала, что объясняет триггерный характер клеточных ответов на пуринергические агонисты.
Ключевые слова: мезенхимные стромальные клетки, пуринорецепторы, Са2+-сигнализация, риано-диновые рецепторы, ^з-рецепторы.
Б01: 10.7868/80233475515040064
ВВЕДЕНИЕ
По современной классификации мезенхимны-ми стромальными клетками (МСК) называют про-лиферирующие недифференцированные клетки, изолированные из определенных тканей (костный мозг, жировая ткань, дерма и ряд других), поддерживаемые в первичной культуре и включающие мультипотентные стволовые клетки [1]. МСК широко используются в экспериментальной регенеративной медицине для восстановления поврежденных органов и тканей, и значительное количество исследований посвящено именно этому вопросу [2, 3]. В гораздо меньшей степени изучены сигнальные и рецепторные системы МСК. Следует отметить, что повреждение тканей
ассоциируется, в частности, с выбросом большого количества ATP во внеклеточную среду. Между тем, внеклеточный АТР и продукты его последовательного гидролиза эктонуклеотидазами — ADP и аденозин — являются первичными медиаторами, вовлеченными в межклеточные коммуникации и паракринные и аутокринные регуляции в самых разнообразных клеточных системах организма [4, 5].
Можно поэтому ожидать, что пуринергиче-ская сигнальная система является естественной частью системы регуляции клеточных функций МСК. Исследованию пуринергической системы МСК посвящено всего несколько работ, в которых описывается экспрессия некоторых типов
пуринорецепторов и вероятная роль в дифферен-цировке клеток. Внутриклеточные события, инициируемые пуринергическими агонистами, не анализировались [6, 7].
В данной работе основное внимание уделено анализу механизмов Са2+-сигнализации, инициируемой в МСК, выделенных из жировой ткани человека, при участии пуринорецепторов. Нами охарактеризованы основные детали возбуждения МСК пуринергическими агонистами и показан вклад механизма Са2+-индуцированного высвобождения депонированного Са2+ (Са2+-тёисеё Са2+ release, CICR) в генерацию АТР-зависимых Са2+-ответов. Полученные данные указывают на то, что пуринергическая трансдукция в МСК протекает по сценарию, во многом аналогичному предложенному нами ранее для адренергической трансдукции [8, 9].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выделение МСК из жировой ткани и их культивирование. МСК человека выделяли из подкожной жировой клетчатки здоровых доноров (возраст от 31 до 50 лет, n = 14). Жировую ткань измельчали и смешивали с растворами коллагеназы типа I (200 ед/мл; Worthington, США) и диспазы (40 ед/мл; Sigma, США) в соотношении объема ткани к объему раствора фермента 1 : 2. Суспензию инкубировали при 37°С в течение 30—60 мин, периодически встряхивали. Затем к полученной суспензии для инактивации ферментов добавляли равный объем среды Advance Stem (HyClone, США), содержащей 10% Advance Stem Supplement (HyClone), и центрифугировали в течение 10 мин при 200 g. Супернатант и верхнюю фракцию адипоцитов удаляли. Осадок ресуспендиро-вали и лизировали эритроциты. Полученную суспензию фильтровали через нейлоновые фильтры с размером пор 100 мкм (BD Bioscience, США). Клетки ресуспендировали в среде роста (см. ниже), высаживали в чашки Петри в количестве 100 тыс. клеток/мл и инкубировали при 37°С и 5% СО2. На следующий день меняли среду для удаления неприкрепленных клеток. Выделенные МСК культивировали на пластиковых чашках Петри (Corning, США) и/или в 12-луночном планшете в среде Advance Stem (HyClone) с 10% Advance Stem Supplement (HyClone), 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина. При достижении 80% монослоя клетки пассировали. Клетки обрабатывали раствором Версена (Sigma) и HyQTase Cell Detachment Solution (HyClone), а затем рассаживали в соотношении 1 : 3. В экспериментах использовали МСК 2—4 пассажей.
Подготовка клеток к эксперименту. Перед экспериментом клетки культивировали в 12-лу-ночном планшете в среде роста (см. выше) без ан-
тибиотика в течение 12 ч, затем двукратно промывали раствором Версена (Sigma). Для отделения от субстрата клетки инкубировали в течение 2—3 мин в 150 мкл фермента HyQTase (HyClone). Фермент ингибировали добавлением 800 мкл полной ростовой среды, клетки ресуспендирова-ли и помещали в пробирку для центрифугирования. Клетки осаждали центрифугированием при 0.8 g в течение 45 с. Клетки прикрепляли с помощью Cell Tak (BD Biosciences, США) на дно фотометрической камеры, представляющей собой покровное стекло (Menzel-Glaser, Германия) с пластиковыми бортиками, и затем загружали флуоресцентным Са2+-зондом Fluo-4. Для этого клетки инкубировали при комнатной температуре (23—25°С) в присутствии проникающего аналога Fluo-4AM (4 мкМ) и детергента Pluronic (0.02%) (Molecular Probes, США) 20 мин, в течение которых в результате гидролиза внутриклеточными эстеразами ацетоксиметиловой группы Fluo-4AM продуцируется достаточное количество Fluo-4. Затем клетки при 4°С в течение 40 мин отмывали внеклеточным раствором, содержащим (мМ): 110 NaCl, 5.5 KCl, 2 CaCl2, 0.8 MgSO4, 10 HEPES, 10 глюкоза, в котором их выдерживали. Когда требовалось 2 мМ CaCl2 во внеклеточном растворе заменяли на 0.5 мМ EGTA + 0.4 мМ CaCl2, в этом случае концентрация свободного Са2+ составляла 260 нМ.
Микрофотометрия. Большинство экспериментов проводили с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 135 (Carl Zeiss, Германия), оборудованного объективом Plan NeoFluar 20x/0.75 и цифровой ECCD камерой LucaR (Andor Technology, США). Помимо осветителя проходящего света, микроскоп был оборудован оптоволоконным осветителем для освещения через объектив. Один из входов бифуркационного оптического волокна соединялся с осветителем на сверхъярких диодах (340— 535 нм) [10] для возбуждения флуоресценции, а другой — с лазером LCS-DTL-374QT ("Лазер-Экспорт", Россия), который использовали для стимуляции фотолиза при длине волны 355 нм. Флуоресценцию клеток, нагруженных Fluo-4, возбуждали на длине волны 480 ± 5 нм, а эмиссию регистрировали в области 535 ± 20 нм. Каждые 0.5 с регистрировали последовательные флуоресцентные изображения. Изменение концентрации ци-тозольного кальция в индивидуальных клетках оценивали по относительному изменению интенсивности флуоресценции целой клетки (AF/F0). Количественный фотометрический анализ изображений осуществляли с использованием программы Imaging Workbench 6 (INDEC, США). Для скачкообразного изменения внутриклеточного Са2+ клетки инкубировали в присутствии фоточувствительного Са2+-хелатора NP-EGTA AM
hi <
ATP
ATP
ADP
UTP Bz-ATP UDP
ATP
100 c
ATP ATP ADP UTP Bz-ATP UDP ATP
100 c
Рис. 1. Ответы АТР-чувствительных МСК на агонисты пуринорецепторов. Представлены репрезентативные регистрации (n = 112) Са2+-ответов двух клеток, иллюстрирующие определенную специфичность к различным агонистам. Здесь и далее начало и длительность стимуляций обозначены горизонтальными линиями выше экспериментальной кривой. Вещества апплицировали в следующих концентрациях (мкМ): АТР — 2, ADP — 2, UTP — 10, Bz-АТР — 10, UDP — 10.
(Molecular Probes, США). Фотолиз NP-EGTA вспышкой света ультрафиолетового диапазона (355 нм) инициировал импульсное высвобождение Са2+ в цитоплазме клетки. В соответствующих экспериментах клетки нагружали Fluo-4, а затем NP-EGTA.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее мы показали, что популяция МСК гете-рогенна по чувствительности к различным агонистам рецепторов, таким как АТР, карбахол, ГАМК, серотонин, норадреналин и др. [9]. В настоящей работе анализировались Са2+-сигналы, инициируемые пуринергическими агонистами в цитоплазме МСК, с использованием метода микрофотометрии (Ca2+ imaging) и Са2+-индикатора Fluo-4. Клетки, чувствительные к ATP, также генерировали Са2+-ответы на другие природные агонисты пуринорецепторов, включая ADP, UTP и UDP (n = 112) (рис. 1). Это свидетельствовало о ключевой роли метаботропных P2Y-рецепторов в генерации клеточных ответов и незначительном вкладе P2X-рецепторов,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.