ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2013, том 60, № 1, с. 17-30
= ОБЗОРЫ
УДК 581.1:581.084.1
ПУТИ СОЗДАНИЯ БИОБЕЗОПАСНЫХ ТРАНСГЕННЫХ БЕЗМАРКЕРНЫХ
РАСТЕНИЙ
© 2013 г. Е. Б. Рукавцова, А. А. Лебедева, Н. С. Захарченко, Я. И. Бурьянов
Филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино Поступила в редакцию 23.01.2012 г.
В обзоре рассмотрены основные стратегии получения биологически безопасных безмаркерных трансгенных растений и проанализированы их достоинства и недостатки. Кратко описаны системы позитивной и негативной селекции как более безопасные подходы выявления трансформантов. Описано использование методов ко-трансформации, транспозиции и сайт-специфической рекомбинации для получения безмаркерных растений. Особое внимание уделено новым подходам к созданию безмаркерных растений, изначально не содержащих селективных генов в своем геноме.
Ключевые слова: безмаркерные трансгенные растения — ко-трансформация — транспозиция — сайт-специфическая рекомбинация — прямой скрининг трансформантов
DOI: 10.7868/S0015330312060139
ВВЕДЕНИЕ
Традиционный способ получения трансгенных растений основан на применении конститутивно экспрессируемых селективных генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам [1] или генов-репортеров [2] для скрининга трансформированных клеток. Наиболее часто используют гены устойчивости к антибиотикам (например, гены неомицинфосфотрансферазы nptII и гигромицинфосфотрансферазы hpt), продукты которых обеспечивают рост трансформированной растительной ткани на селективной среде. Экспрессия других селективных генов в трансгенных растениях может дать метаболическое преимущество, улучшая рост и дифференцировку трансформированных тканей. Репортерные гены, такие как гены ß-глюкуронидазы gusA (uidA) или зеленого флуоресцентного белка gfp, позволяют
Сокращения: bar — ген фосфинотрицин-М-ацетилтрансфера-зы; codA — ген цитозиндезаминазы; gfp — ген зеленого флуоресцентного белка; gusA, uidA — ген ß-глюкуронидазы; hpt, hph — ген гигромицинфосфотрансферазы; ipt — ген изопен-тенилтрансферазы; manA, pmi — ген фосфоманнозоизомера-зы; nptII — ген неомицинфосфотрансферазы; xylA — ген кси-лозоизомеразы; Ac — ассоциатор; Ds — диссоциатор; CaMV 35S — промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; Cre/lox, FLP/FRT, R/RS — системы сайт-специфической рекомбинации.
Адрес для корреспонденции: Рукавцова Елена Борисовна. 142290 Пущино, просп. Науки, 6. Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Факс: 007 (4967) 33-05-27; электронная почта: ruk@fibkh.serpukhov.su
вести визуальный скрининг трансформированных растительных клеток.
Однако после завершения отбора трансформированных растений присутствие в их геноме маркерных генов становится бесполезным, а их эффект непредсказуемым и даже потенциально опасным. За счет переопыления и горизонтального переноса генетического материала возможно неконтролируемое распространение селективных генов в природных популяциях растений или микроорганизмов. Возможность горизонтально -го переноса генов устойчивости к антибиотикам кишечной микрофлоре животных и человека, а также вертикального переноса генов устойчивости гербицидам сорным растениям на всем протяжении развития генетической инженерии растений вплоть до настоящего времени воспринимается как основная проблема биологической опасности генетически модифицированных культур [3, 4]. Используемые в настоящее время коммерческие трансгенные растения с селективными генами устойчивости к антибиотикам и гербицидам выращиваются на огромных площадях и представляют существенную потенциальную экологическую опасность. В связи с этим, стоит проблема разработки методов получения трансгенных растений нового поколения без "генетического мусора", к которому относятся селективные и скрининговые гены-репортеры.
В связи с назревшей необходимостью удаления из растений этих генов в настоящее время разрабатываются подходы к созданию поколения
безмаркерных трансгенных растений с повышенной биобезопасностью. Существует несколько основных стратегий получения таких растений, которые будут рассмотрены в данном обзоре.
СЕЛЕКТИВНЫЕ МАРКЕРНЫЕ ГЕНЫ
В последнее время для создания трансгенных растений используют не только гены устойчивости к антибиотикам и гербицидам, но и более безопасные гены, экспрессия которых обеспечивает так называемые позитивную или негативную селекцию. Позитивными маркерами называют селективные гены, продукты которых обеспечивают рост трансформированных растений в определенных условиях in vitro и in vivo. Негативные маркерные гены в результате своей экспрессии вызывают гибель трансформированных растений.
К условно-позитивным маркерам можно отнести традиционные гены устойчивости к антибиотикам и гербицидам, поскольку они обеспечивают выживание трансформированных растительных клеток на средах, содержащих токсичные реагенты. Все большее распространение получают позитивные маркеры, не требующие использования токсичных веществ при получении трансгенных растений. Продукты таких генов обеспечивают утилизацию нетрадиционных субстратов для роста растений, например, D-ксилозы (ген xylA) [5], D-маннозы (ген manA илиpmi) [6] и 2-дезоксиглю-козы (ген DOGR1) [7]. Например, ген pmi кодирует фермент фосфоманнозоизомеразу, которая превращает маннозо-6-фосфат во фруктозо-6-фосфат (промежуточный продукт гликолиза), используемый трансформированными клетками в качестве источника углерода. Для нетрансформированных растительных клеток манноза является токсичной, поскольку способна конвертироваться в них до маннозо-6-фосфата — ингибитора гликолиза. Ген pmi из Escherichia coli использован для трансформации ряда однодольных и двудольных растений [6, 8]. Некоторыми исследователями отмечено, что использование гена pmi значительно повышает эффективность трансформации по сравнению с традиционной селекцией на среде с канамицином [8]. Однако данный селективный ген применим не для всех растений, поскольку в клетках некоторых бобовых, в частности, сои, обнаружена активность фосфоманнозоизомеразы [9].
Для позитивной селекции можно также использовать агробактериальный ген изопентенил-трансферазы ipt, ответственный за синтез цито-кининов в растительных тканях [10]. Экспрессия этого гена в трансгенных растениях приводит к изменению их фенотипа (карликовость, отсутствие корней, кустистость) за счет изменения гормонального статуса.
Одним из эффективных маркеров для негативной селекции трансгенных растений является бактериальный ген цитозиндезаминазы codA. Фе-нотипическое проявление экспрессии codА можно назвать условно летальным, поскольку она не заметна при культивировании трансгенных растений на обычной среде, но вызывает их гибель на среде с 5-фторцитозином [11]. Наличие гена codA в составе кассеты наряду с генами для позитивной селекции позволяет вести отбор растений, потерявших маркерные гены в результате естественных или искусственно вызванных геномных перестроек (случайные мутации, генетическая рекомбинация или сайт-направленное вырезание генов).
В дополнение к селективным маркерным генам при создании трансгенных растений нередко используют так называемые репортерные гены, продукты которых дают возможность сразу судить об экспрессии встроенной генетической конструкции и оценивать успешность трансформации растения [2]. Расширение списка доступных для практического использования репортер-ных генов будет увеличиваться по мере создания новых хромогенных и флуорогенных субстратов для различных ферментов.
В то же время, несмотря на растущее число селективных и репортерных маркерных генов, лишь некоторые из них нашли применение при создании трансгенных растений. Это обусловлено трудоемкостью и длительностью даже первичных экспериментов по тестированию их экспрессии. При этом недостатки многих из маркерных генов остаются недостаточно очевидными. Неоднозначным является ответ на вопрос о биологической безопасности маркерных генов, эффект от распространения которых в природной среде может проявиться лишь через много лет после начала их применения.
СТРАТЕГИИ СОЗДАНИЯ БЕЗМАРКЕРНЫХ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ
В настоящее время существует несколько стратегий создания трансгенных растений, не содержащих потенциально опасных селективных маркеров. Например, при ко-трансформации целевой и маркерный ген располагаются в двух независимых Т-ДНК в одном или двух агробактери-альных штаммах. Двойные трансформанты скрещивают и отбирают потомство без селективного гена. Вторая стратегия заключается в перемещении любого из генов, целевого или маркерного, с использованием транспозиции, в частности, системы мобильного элемента кукурузы Ас/Ds, и последующем удалении маркерного гена из растительного генома. Третья стратегия получения безмаркерных растений основана на системах сайт-специфической рекомбинации из бактерий
1. Ко-трансформация
С использованием С одной плазмидой,
двух плазмид , содержащей несколько
Т-ДНК
Баллистическая ко-трансформация с использованием линейных фрагментов ДНК (без Т-ДНК)
2. Транспозиция (Ac/Ds)
Перемещение целевого гена
Удаление селективного гена (система МАТ)
3. Сайт-специфическая рекомбинация
Система Сге/1ох
4. Методы прямого скрининга трансформантов
Система FLP/FRT Прямой скрининг трансформантов
Система R/RS с помощью ПЦР
Прямой скрининг трансформантов по наличию продукта экспрессии целевого гена
Рис. 1. Основные стратегии получения безмаркерных трансгенных растений.
и грибов. При этом селективный ген фланкируют специфическими сайтами (1ох, ЕЯТ, которые распознаются, и ген элиминируется из растительного генома с помощью рекомбиназ (Сге, БЬР, Я). Помимо перечисленных методов получения безмаркерных растений развиваются и новые подходы, основанные на прямом скрининге трансформантов и не требующие вырезания селективных генов из генома растений (рис. 1). Все эти стратегии рассмотрены ниже.
КО-ТРАНСФОРМАЦИЯ МАРКЕРНОГО И ЦЕЛЕВОГО ГЕНОВ
Под термином "ко-трансформация" понимают одновременную доставку и интеграцию в геном расте
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.