== МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.2.043:539.1:576.3.043:539.1:575.1:575.224
РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ СТРУКТУРНО РАЗНЫХ ГЕНОВ
Drosophila melanogaster. СООБЩЕНИЕ 5. ГЕН cinnabar: ОБЩАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЕГО РАДИОМУТАБИЛЬНОСТИ © 2014 г. Л. Н. Давкова*, И. Д. Александров, М. В. Александрова
Объединенный институт ядерных исследований, Дубна, Россия
Приводятся результаты генетического, цитогенетического и молекулярного анализа рецессивных мутаций гена cinnabar (cn) Drosophila melanogaster, индуцированных у-излучением 60Co (дозы 5— 60 Гр) и реакторными нейтронами (Еср = 0.85 МэВ, дозы 2.5—20 Гр) в зрелых спермиях самцов дикой лабораторной линии D32. Показано, что общий спектр индуцированных обоими видами радиации мутаций гена включает два главных класса генетических изменений: 1) "точковой" (простые и комплексные) и 2) хромосомной природы (мутанты с доминантной стерильностью и мультилокусные делеции). Для обоих видов радиации частота мутаций двух классов растет с дозой линейно, однако нейтроны существенно более эффективны, чем у-излучение, в индукции только хромосомных мутаций (коэффициент ОГЭ = 4.0), но не "точковых", где эффективность обоих видов радиации практически одинакова. Установлено, что 28 из 59 (47.5%) изученных у- и нейтрон-индуцированных "точковых" мутантов cn имеют ПЦР детектируемые изменения ДНК гена в виде делеций отдельных или двух смежных фрагментов гена, тогда как остальные мутанты (31 из 59, или 52.5%) обусловлены молекулярными изменениями, не определяемыми методом ПЦР. Существенно, что 10 из 48 (20.8%) у- и 3 из 11 (27.3%) нейтрон-индуцированных "точковых" мутантов имели молекулярный "фенотип" (отсутствие смежных 3-го и 4-го фрагментов гена), идентичный "фенотипу" маркерной мутации cn1 из материнской тестер-линии KL, с самками которой скрещивались облученные самцы. Среди обсуждаемых процессов генетической рекомбинации, потенциально ведущих к наблюдаемому "фенотипу", наиболее вероятной является межаллельная рекомбинация (генная конверсия) в ядре зиготы после первого акта репликации и объединения интактного материнского и облученного отцовского геномов. Установленная в работе картина радиационного мутагенеза гена cn сравнивается с таковой для близкого по размеру и структуре гена black, но с иным положением на хромосоме.
Нейтроны, у-излучение, Drosophila melanogaster, ген cinnabar, рецессивные "точковые" и хромосомные мутации, ОГЭ, ПЦР.
DOI: 10.7868/S0869803114010044
Первые работы по сравнительной радиационной биологии генов Drosophila melanogaster показали, что два разных по величине, внутренней организации и положению в геноме гена black+ [1] и vestigial+ [2, 3] имеют наряду с общими и ген-специфические закономерности в их целостной картине радиомутабильности. Так, при наличии у двух генов обоих главных классов наследуемых мутаций ("точковые" и хромосомные) соотношение отдельных типов мутаций в каждом классе существенно зависит от качества действующей радиации и, возможно, от величины и организации самого гена. В частности, по классу "точковых" мутаций картина радиомутабильности гена black+ необычна по сравнению с таковой гена vestigial+
* Адресат для корреспонденции: 141980 Дубна, Московская обл., ОИЯИ, ЛЯП; тел.: (49621) 6-25-79; факс: (49621) 6-66-66; e-mail: liliana.namolovan@gmail.com.
(vg+) по меньшей мере в двух отношениях: 1) частота индукции нейтронами деления "точковых" мутаций в гене black в 2—4 раза выше (в зависимости от дозы), чем в гене vg, и 2) практически все как у- , так и нейтрон-индуцированные "точко-вые" мутанты black имеют мутационные изменения ДНК, не определяемые методом полиме-разной цепной реакции (ПЦР), в отличие от таковых гена vg, где большинство таких мутантов имеют внутренние делеции разной величины [3]. В то же время, по классу хромосомных мутаций картина радиомутабильности двух генов прямо противоположная, а именно, нейтроны более эффективны в индукции хромосомных мутаций vg, чем black. При этом в спектре хромосомных мутаций vg, в отличие от black, преобладают внутри-хромосомные обмены (инверсии) [2]. На данном этапе исследований вполне резонно предположить, что установленные различия в картине ра-
fs(2)43Ei
Центромера
направление транскрипции
+3869 +2056 ex3 +1816 +1748
ex2
in2 I I
I I
+704 +291 ex1 +1 0
in1
I 2
Рис. 1. Генетическая карта района гена cinnabar+ аутосомы 2R D. melanogaster [4] (a) и разные уровни его молекулярной организации: б — нуклеомерно-соленоидный, в — нуклеосомный и г — экзонно-интронный (ex-in); д — положение фрагментов-ампликонов (1—4), соответствующих изучаемым районам гена; cn1 — размер и положение делеции у спонтанной мутации cn1 с координатами +1852 и +3686. 3D модель гена cinnabar построена на основании существующих представлений о нуклеосомно-нуклеомерно-соленоидной организации интерфазного хроматина эукариот [7].
а
в
г
4
д
1
3
диомутабильности относительно небольшого гена black+ и более крупного гена vg+ предопределены такими биологическими факторами, как особенности молекулярной организации самих генов, их ближайшего геномного окружения, положения на хромосоме и в 3D геноме. Если это так, то феноменология радиационного мутагенеза по изученным тестам в аналогичных условиях эксперимента для других столь же относительно небольших генов должна быть, по-видимому, близка той, что установлена для гена black.
Для проверки этого предположения и дальнейшего изучения основ радиационной биологии генов эукариот нами проведен комплексный, включая молекулярный, анализ у- и нейтрон-ин-дуцированных мутаций гена cinnabar+ (cn+), полученных одновременно и независимо от black и vg в тех же радиационно-генетических экспериментах. Как будет показано ниже, полученные результаты, не подтверждая нашего предположения о единой картине радиомутабильности для двух небольших генов black+ и cn+, дают первое и достаточно полное представление об общих и специфических закономерностях мутирования при-
ближенного к центромере гена т+, установленных на хромосомном и молекулярно-генетическом уровнях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Ген т+ D. melanogaster (цитология: 43Е16 поли-тенной аутосомы 2Я; генетическая локализация: 57.5) размером 2056 пар нуклеотид (п.н.) состоит из 3 экзонов и 2 интронов (76.6 и 23.4% ДНК гена соответственно) [www.FlyBase.org] (рис. 1). Продуктом гена является фермент кинуренин-3-мо-нооксидаза, мутационная инактивация которого ведет к изменению окраски глаза от красно-коричневой у диких имаго до алой у мутантов [4]. Среди описанных в литературе мутантных аллелей гена [4] наиболее широко известна и используется в различных лабораторных линиях в качестве маркера рецессивная "точковая" мутация cn1, в основе которой лежит делеция около 1800 п.н., ведущая к функционально неактивному продукту гена [www.FlyBase.org]. Сопоставление этой делетированной последовательности гена с нормальной [5] позволило нам точно определить размер делеции в 1834 п.н. и локализовать ее
Таблица 1. Результаты ПЦР-анализа нейтрон-индуцированной делеции cn79b13 [6] в компаунде с "точковыми" мутациями имеющими делеции разных фрагментов гена
Генотип компаундов Фрагменты гена cn+
1 2 3 4
cn79b13/cn77a3* - + + +
cn79b13/cn81k1 - - + +
cn79b13/cn79d1 + - - +
cn79b13/cn88b37 + + - +
cn79b13/cn1 + + - -
cn79b13/cn88g43** + - - -
cn79b13/cn85c2*** - - - -
Примечание. * Происхождение этой и следующих четырех мутаций см. табл. 2; ** Df(2R)43E5-E18 [6] индуцирована комбинированным облучением (п + у) в дозе 15 Гр; *** Df(2R)43D5; 43F2 [6] индуцирована нейтронами в дозе 15 Гр.
начало и конец в положениях + 1852 и +3686 соответственно. Именно этой мутацией маркирован сложный генотип самок тестер-линии KL (y scS1 dl49 sc8 wa (M5); b1 cn1 vg1), с которыми скрещивались интактные и облученные самцы дикой лабораторной линии D32 для получения в F1 мутантов по этому гену.
Изученные в работе мутанты cn получены в тех же радиационно-генетических экспериментах, что и мутанты black и vg [1—3]. Там же описаны физические условия облучения у-квантами 60Со, реакторными нейтронами с Еср = 0.85 МэВ, комбинированным воздействием нейтронами и у-квантами, смешанным у-нейтронным излучением 252Cf и детали классического цито- и генетического анализа мутаций с их классификацией на три основных класса: 1) ненаследуемые мутации F1 c доминантной стерильностью; 2) наследуемые хромосомные мутации разного типа и 3) "точко-вые" мутации простой и комплексной природы. Учитывая тот факт, что значительное число "точ-ковых" мутаций cn оказалось комплексной природы (сочетание мутации cn с независимо индуцированной в этой же хромосоме рецессивной леталью), нами были проведены эксперименты по отделению таких рецессивных леталей от мутации cn с помощью мейотической рекомбинации у гетерозигот: Bl + +/+ cnxl. В тех случаях, когда рецессивная леталь оказывалась тесно сцеплена с мутацией cn и не отделялась кроссинговером в выборках стандартного размера (800—1500 некроссоверных особей), мутации переводились в гемизиготное состояние с использованием небольшой делеции cn79b13 (Df(2R)43E2-43E18) [6]. Данные, подтверждающие наличие делеции всего гена cn у мутации cn79b13, получены в опытах по ПЦР анализу гетерозигот от скрещивания cn79b13 с набором "точ-ковых" мутаций cn с делециями тех или иных фрагментов гена (табл. 1). Как видно из таблицы,
все использованные в этих опытах "точковые" мутации cn проявляют свойственные им молекулярные изменения в виде делеций того или иного фрагмента гена (табл. 2) в компаунде с cn79b13, т.е. находятся в гемизиготном состоянии.
Молекулярная природа 48 у- и 5 нейтрон-ин-дуцированных, а также 6 после комбинированного воздействия (нейтроны + у-кванты) "точко-вых" мутаций cn, случайно выбранных из общей генетической коллекции, нами изучена с использованием метода ПЦР, для чего область генома с геном cn была подразделена на четыре перекрывающихся фрагмента (рис. 1), к которым с использованием программы NCBI/Primer-BLAST подобраны уникальные пары праймеров (табл. 3).
Геномную ДНК мутантов гомо- или гемизигот для ПЦР выделяли, используя набор реагентов "Diatom
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.