УДК [57+61]::539.1.04:595.773.4:57.017.3:577.151.645:591.15
РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННАЯ ФРАГМЕНТАЦИЯ ДНК В КЛЕТКАХ СОМАТИЧЕСКИХ И ГЕНЕРАТИВНЫХ ТКАНЕЙ
Drosopphila melanogaster
© 2015 г. Е. А. Юшкова1,2, *, В. Г. Зайнуллин1
Институт биологии Коми Научного центра УрО РАН, Сыктывкар 2Сыктывкарский государственный университет
Проведена оценка уровня фрагментации ДНК (с использованием нейтральной версии метода "ДНК-комет") в клетках соматических (нервных ганглиев) и генеративных (семенниках) тканей инбредных дрозофил дикого типа, развивающихся в разных условиях хронического облучения. Установлено, что радиобиологический эффект зависит от генотипа и цитотипа линии. Облучение в малых дозах (0.42 мГр/ч) одинаково индуцирует образование повреждений ДНК в соматических клетках всех исследуемых линий дрозофилы. С увеличением мощности хронического облучения (3.5 мГр/ч) значимый выход ДНК-разрывов в нейробластах наблюдали только для линий Harwich и Oregon-R, в клетках семенников — для всех изученных генотипов.
ВгоъорНПа melanogaster, у-излучение, частота повреждений ДНК, клетки соматических и генеративных тканей.
БО1: 10.7868/80869803115010178
На сегодняшний день наиболее остро стоит проблема оценки последствий радиационных воздействий для популяции организмов. Опасность действия ионизирующих излучений может проявляться в виде снижения выживаемости и функционирования организма, обусловленных формированием в клетке повышенного уровня повреждений ДНК.
Образование повреждений ДНК является основным событием большей части реакций радиа-ционно-индуцированной генетической нестабильности [1, 2]. Потенциально опасными для клетки являются двунитевые разрывы (ДР) ДНК, которые могут не восстановиться в ходе репарации, что приводит к различным цитогенетиче-ским нарушениям [3]. В условиях облучения в малых дозах вероятность двунитевых разрывов ничтожно мала [3], поэтому полагают иной механизм индукции двуцепочечных разрывов — изменения транспозиционной активности мобильных элементов [4].
В данной работе была предпринята попытка оценить частоты индуцированных облучением низкой интенсивности разрывов ДНК в половых
* Адресат для корреспонденции: Республика Коми, 167982 Сыктывкар, ул. Коммунистическая, 28; ФГБУН Институт биологии Коми НЦ УрО РАН; тел.: (8212) 43-06-50; факс: (8212) 24-01-63; e-mail: ushkova@ib.komisc.ru.
и соматических клетках линий дрозофилы, различающихся по генотипу и цитотипу.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Материалом исследования служили клетки соматических (нервные ганглии) и генеративных (семенники) тканей дрозофил дикого типа, подвергавшихся хроническому облучению. Дисген-ный статус и цитотип исследуемых линий дикого типа D. melanogaster определяли по стандартным методам оценки стерильности дисгенных особей [5—7] и мутабильности маркерных локусов [8, 9]. Используемые в эксперименте лабораторные линии дрозофилы имеют следующие цитотипиче-ские характеристики:
Canton-S — линия, имеющая Е-, I- и М-цито-типы. Используется в дисгенных скрещиваниях в качестве индукторной (в I-R системе гибридного дисгенеза (ГД)) и реактивной (чувствительной к P- и hobo-факторам) линии. Отличается от других генотипов наличием в своем геноме LINE-подоб-ных I-ретротранспозонов, отвечающих за формирование I-цитотипа [10].
Charolles — линия М- и R-цитотипа, чувствительная к транспозициям I- и Р-элементов [11, 12].
Harwich — индукторная линия в Р-М системе ГД. Содержит в генотипе полноразмерные копии Р-транспозона и имеет Р-цитотип [13].
Oregon-R — линия индукторного типа (Н-цито-тип), имеющая в генотипе полные функциональные копии hobo-элемента. Используется в Н-Е дисгенных скрещиваниях [14].
Линии D. melanogaster получены из коллекционного Центра в Блумингтоне (Университет штата Индиана, Блумингтон, США).
В работе использовали полученные в результате тесного инбридинга (от одной пары родителей, на протяжении четырех поколений) генетически однородные выборки изучаемых генотипов дрозофилы [15]. Часть особей каждой линии подвергали воздействию хронического у-излучения (226Ra, 56 мГр/ч) при мощностях экспозиционной дозы 0.42 и 3.5 мГр/ч (накопленные дозы за поколение (12 дней) составили 0.12 и 1 Гр, соответственно). Другую часть особей использовали в качестве контроля. Эксперимент проводили в трех повторностях. Анализ уровня повреждений ДНК оценивали у потомков облученных родителей.
Культивирование дрозофил проводили в климатической камере KBWF 240 (Binder, Германия) при стандартных условиях: температуре 25 ± 0.1°С, влажности 60 % и фотопериодичности 12 ч свет/12 ч темнота.
Уровень фрагментации ДНК, обусловленный образованием ДР, в клетках соматических и генеративных тканей дрозофил определяли модифицированным методом "ДНК-комет" в нейтральной версии рН [16, 17]. Клеточную суспензию, полученную из нервных ганглиев личинок третьего возраста и семенников виргинных самцов (20 особей на вариант, на повторность), инкубировали в теплом (37°С) растворе коллагеназы (тип IV, 0.5 мг/мл PBS). Суспензии клеток соматических и генеративных тканей (10 мкл) смешивали с 0.5%-ной легкоплавкой агарозой (100 мкл) на предметных стеклах, предварительно покрытых слоем 1%-ной нормоплавкой агарозы, и перед лизисом оставляли их при температуре 4°С в течение 20 мин. Стекла с соматическими клетками (нейробластами) помещали в холодный лизи-рующий раствор (4°С) без добавления протеина-зы К (2.5 моль/л NaCl, 10 ммоль/л Na2EDTA, 20 ммоль/л Tris-HCl, 1% Triton X-100, pH 10.0). Напротив, клетки семенников подвергали лизису в теплых условиях (37°С) в растворе (2.5 моль/л NaCl, 10 ммоль/л Na2EDTA, 20 ммоль/л Tris-HCl, 1% Triton X-100, pH 10.0, 0.5 % SDS), содержащем протеиназу К (0.15 мг/мл). В обоих случаях клетки лизировали без добавления диметилсульфок-сида (ДМСО) и на протяжении 2 ч [18].
Электрофорез (при условии 30 мА, 0.7 В/см, 4°С, 20 мин) проводили в охлажденном (4°С) нейтральном буфере (0.9 моль/л Trizma-Base,
0.9 моль/л борная кислота, 20 ммоль/л Na2EDTA, рН 8.3), далее проводили фиксацию препаратов в 70 %-ном этаноле в течение 15 мин. Для электро-форетического разделения использовали камеры SUB-CELL®GT (Bio-Rad, Россия).
Препараты окрашивали раствором SYBR Green I (0.2 мкл/мл в ТЕ-буфере, рН 7.5) (ДНК-синтез, Россия) и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа "Infiniti XS-148 FS". Обработку изображения "комет" проводили с использованием программы CometScore™ (версия 1.5, TriTek Corp., США) (http://autocom-et.com/main_home.php). В качестве показателя, оценивающего уровень повреждений ДНК, был выбран параметр ОТМ (Olive tail moment), определяемый как произведение расстояния от центра головы до центра плотности хвоста "кометы" на %TDNA (концентрацию ДНК в хвосте "кометы") [19, 20]. На каждый вариант каждой повторности подсчитано 200 клеток (всего на 1 вариант проанализировано 600 клеток).
Выбор нейтральной версии метода обусловлен прежде всего тем, что электрофорез ДНК, проводимый в данных условиях среды, позволяет идентифицировать преимущественно двунитевые разрывы ДНК [21], в то время как щелочной гель-электрофорез используется в основном для оценки выхода однонитевых разрывов и щелочела-бильных сайтов [16]. Важно отметить, что применение нейтральной версии метода "ДНК-комет" для определения повреждений ДНК в клетках генеративных тканей является более информативным, чем щелочной вариант [22, 23].
Для установления в геномах линий дрозофилы содержания Р- и hobo-элементов применяли метод ПЦР. ДНК выделяли из взрослых особей дрозофилы с помощью коммерческого набора "Diatom™ DNA Prep 200" (ИзоГен, Россия). Очистку ДНК проводили на приборе "QIAcube" (QIAGEN, Германия). Геномную ДНК добавляли из расчета 50 нг на пробу. Измерение концентрации ДНК проводили на флуориметре Quibit® (In-vitrogen, США). В амплификации открытой рамки считывания (ORF) полноразмерного hobo-эле-мента, имеющей длину 2 т. п. н., использовали праймеры 5' - GCGCCATACATAATGATTG- 3' и 5'-CTATTGCGAGTTGTTTAG-3'. Параметры амплификации hobo-элемента были следующими: начальная денатурация 94°С, 3 мин, последующая денатурация 94°С, 30 с, отжиг 54°С, 30 с, синтез 72°С, 100 с (35 циклов), элонгация 72°С, 5 мин [24]. Для полноразмерного Р-элемента размером 2.8 т. п. н. амплификацию вели в присутствии праймеров 5' - GAGAGGAAAGGTTGTGTGCG-GACGA-3' и 5'- GCTTGCAATAAGTGCGAGT-
* 1.4
о
1.2
£ 1.0
0.8 0.6 0.4 0.2
0
□ Контроль
□ 0.12 Гр
ЕЗ 1 Гр
A
Canton-S Harwich Charolles Oregon-R Линия
3.5 3.0 ц 2.5
<D
3 2.0
^
S L5
Т
О 1.0
0.5
0
□ Контроль _ □ 0.12 Гр в 1 Гр
Б
т**
**
ш
Canton-S Harwich Charolles Oregon-R Линия
Рис. 1. Частота радиационно-индуцированных повреждений ДНК в клетках соматических (А) и генеративных (Б) тканей D. melanogaster.
Различия достоверны с контролем при *р < 0.05; **р < 0.01.
*
GAAAGG-3' при условии: начальная денатурация 94°С, 3 мин, последующая денатурация 94°С, 60 с, отжиг 65°С, 60 с, синтез 72°С, 2 мин (29 циклов), элонгация 72°С, 5 мин [24]. ПЦР-амплифи-кацию делали на термоциклере ESCO Swift Mini Pro (ESCO, Сингапур) с помощью реагентов "GenPak® PCR MasterMix Core". В качестве контроля использовали деионизированную воду. Детекцию результатов ПЦР осуществляли методом горизонтального электрофореза в 1.3%-ном ага-розном геле, содержащем краситель SYBR Green I (ДНК-синтез, Россия). Визуализацию электрофореграмм проводили на трансиллюминаторе ЕСХ-15.М (Vilber Lourmat, Франция) с помощью видеосистемы Gel Imager (ДНК-Технология, Россия). Молекулярно-генетический анализ проводили на базе Центра коллективного пользования Института биологии Коми НЦ УрО РАН "Молекулярная биология".
Статистическую обработку результатов проводили в программе STATISTICA (версия 7.0.61.0, StatSoft, Inc., США, лицензия № 3145689012). Достоверность различий между средними значениями параметра ОТМ интактных и облученных вариантов определяли по t-критерию Стъюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Полученные результаты свидетельствуют (рис. 1, А), что воздействие хронического у-излу-чения малой интенсивности (0.42 мГр/ч) вызывает достоверно повышенный уровень фрагментации ДНК в соматических клетках у
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.