ХИМИЯ ВЫСОКИХ ЭНЕРГИЙ, 2004, том 38, № 2, с. 113-119
РАДИАЦИОННАЯ ХИМИЯ
УДК 541.15:541.18
ИССЛЕДОВАНИЕ РАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ ПРИ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОМ РАДИОЛИЗЕ ДИСПЕРСИЙ ЛИПОСОМ
© 2004 г. Д. В. Парамонов*, В. И. Трофимов*, А. А. Князев**
*Научно-технический центр "Лекбиотех" 115478, Москва, Каширское шоссе, 24 Е-mail: avt302871@mtu-net.ru **Центр фотохимии Российской академии наук 119421, Москва, ул. Новаторов, 7а Поступила в редакцию 02.04.2003 г.
Исследованы процессы с участием радиолитических радикалов, протекающие при низкотемпературном радиолизе водных дисперсий липосом. Определены начальные радиационно-химические выходы образовавшихся радикалов и их превращения при размораживании систем. Установлено, что ионол (2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол), введенный в липидный бислой липосом, является эффективным акцептором радиолитических частиц, образующихся в замороженной (77 К) дисперсии при облучении.
В работах [1-6] нами были исследованы радиационно-химические процессы, протекающие в водных дисперсиях липосом (используемых как в модельных экспериментах при проведении ряда биологических, биоорганических и фармацевтических исследований, так и в косметической и фармацевтической индустрии) при у-облучении. Установлено, что активные продукты радиолиза, генерируемые излучением в водной фазе, взаимодействуют с поверхностью липидного бислоя липосом, образуя липидные радикалы. Вторичные химические реакции в липидном бислое с участием лецитиновых радикалов приводят к деградации молекул и распаду структуры бислоя. Инги-бирование процесса генерации лецитиновых радикалов на стадии их образования во вторичных реакциях приводит, по нашему мнению, к повышению стабильности бислойной структуры в целом. Исследование природы образующихся при облучении радикалов даст возможность более детально изучить процесс деградации липидного бислоя. Процессы накопления (при облучении) и гибели радикалов в дисперсиях липосом исследовали в замороженном состоянии.
МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
Образцы (лецитиновые дисперсии, водные растворы, отдельные компоненты, составляющие дисперсию, и их смеси) помещали в капилляры (масса образца колебалась в пределах 0.03-0.13 г) для ЭПР-исследований из стекла "Луч" диаметром 3.5-4 мм и замораживали до 77 К в два этапа. Сначала образцы помещались в морозильную камеру "SANYO" (температура термостата моро-
зильной камеры 243 ± 3 К), а непосредственно перед облучением охлаждались путем погружения в жидкий азот до температуры 77 К. Для водных систем скорость охлаждения образцов до температуры кристаллизации в термостате морозильной камеры составляла 22 ± 2 градуса/мин, время кристаллизации - 1.5 мин. у-Облучение образцов проводили при температуре кипения жидкого азота в сосудах Дьюара на кобальтовой установке РЦ-100М. Поглощенная доза у-излучения варьировалась в пределах 25-65 кГр с мощностью дозы 2 Гр/с. Дозиметрию проводили ферросульфат-ным дозиметром Фрикке в том же сосуде Дьюара, заполненным имитатором жидкого азота (наполнителем с плотностью ~0.81 г/см3).
Количество и вид радикалов, образовавшихся в системе, определяли путем регистрации спектров ЭПР. Для записи сигналов ЭПР радикалов в облученных при температуре кипения жидкого азота образцах использовался радиоспектрометр ЭПР-В (резонатор цилиндрического типа Н011, рабочая частота 9300 МГц, частота модуляции магнитного поля 100 кГц). Предельная чувствительность 5 х 1011 спин/мТ. Регистрировалась первая производная от спектра поглощения. Регистрация спектров и управление спектрометром проводилось при помощи ЭВМ. Анализ образцов проводили в кварцевом сосуде Дьюара с жидким азотом, помещенным в резонатор спектрометра. Разогрев образцов до определенной температуры осуществляли путем выдерживания ампул в потоке холодного азота до установления в системе теплового равновесия. Температуру образцов измеряли термометром с медь-константановой термопарой. Регулировку температуры образцов осуществля-
ли путем изменения скорости подачи паров азота из сосуда Дьюара через ячейку с образцом. После разогрева образца до определенной температуры образец фиксировали в жидком азоте, и при этой температуре проводили спектроскопические измерения. Анализ сложных спектров проводился на ЭВМ с использованием системы МАТЬАБ 5.0. Сложный спектр представляли в виде суммы спектров отдельных радикалов с соответствующими коэффициентами. Вид спектров отдельных радикалов определялся экспериментально в опытах с однокомпонентными (вода, лецитин, ионол) системами. Количество радикалов в образце определяли путем двойного интегрирования соответствующего спектра. Погрешность приведенного метода определения количества радикалов в системах составляла около 30%.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для изучения процессов образования и превращения радикалов в липидном бислое использовали липосомы с введенным акцептором радикалов -ионолом (2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол). Поскольку такая многокомпонентная система является достаточно сложной для анализа и интерпретации полученных спектров ЭПР, то для расшифровки и последующего анализа спектров параллельно проводились эксперименты с более простыми однокомпонентными системами. В экспериментах по низкотемпературному радиолизу замороженных и облученных при 77 К дисперсий липосом исследовались восемь систем :
1) дисперсия липосом (слецитин = 94 мг/мл) с включенным в липидный бислой акцептором -ионолом (сионола = 2.5 х 10-4 моль/глец);
2) дисперсия липосом (слецитин = 94 мг/мл) с включенным в липидный бислой акцептором -ионолом (сионола = 2.5 х 10-4 моль/глец) и содержащая в водной фазе акцептор электронов - КК03 (0.1 моль/л);
3) дисперсия ненагруженных ионолом липосом (Слецитин = 94 мг/мл);
4) смесь лецитина с ионолом (сионола = 2.5 х х 10-4 моль/глец);
5) чистый лецитин;
6) чистый акцептор (ионол);
7) дистиллированная вода, содержащая акцептор электронов - КК03 (0.1 моль/л);
8) дистиллированная вода.
Для всех систем исследовался качественный и количественный состав радикалов, образующихся при облучении систем при 77 К, начальные ра-диационно-химические выходы образовавшихся радикалов и превращения образовавшихся при облучении радикалов при размораживании об-
разцов. Количество и вид радикалов, образовавшихся в системе после облучения, определяли путем регистрации спектров ЭПР. Данные, полученные из экспериментов по облучению одно-компонентных систем (дистиллированная вода, ионол, лецитин), использовались для расшифровки данных для сложных систем (вода-лецитин, вода-лецитин-ионол, водный раствор нитрата калия-лецитин-ионол). Спектры ЭПР (соответствующие параметры спектра, определенные в ходе эксперимента, приведены в подписях к рисункам) для однокомпонентных систем представлены на рис. 1а-1г, а их термическая гибель при разогреве образцов - на графике (рис. 1д). Идентификацию полученных таким образом спектров радикалов проводили при помощи сравнения с известными из литературы данными (видом спектра ЭПР, g-фактором, температурным интервалом гибели радикала). В частности, установлено, что образовавшиеся при радиолизе дистиллированной воды, ионола и лецитина радикалы соответствуют следующим (в скобках приведены данные из литературы). Для воды - OH' -радикалы (анизотропный дублет, g = 2.045, gL = 2.008, а = = 4 мТ, температурный интервал термической гибели 90-110 К [7-9]). Для ионола - вид ЭПР-спект-ра, полученного при его облучении (77 К), свидетельствует, что образуется набор радикалов; фе-ноксильные радикалы составляют примерно 35% от общего количества радикалов (квартет (1 : 3 : 3 : 1, а(4-СН3) = 1.074 мТ) триплетов (1 : 2 : 1, а(Н-3.5) = = 0.17 мТ), ширина спектра 3.57 мТ, g = 2.00437 ± ± 0.00003 [10, 11]). В работе [12] было установлено, что при радиолизе 4-окси-3,5-ди-трет-бутил-а-метилбензиламина в аналогичных условиях, кроме феноксильных радикалов образуются Н-аддукты (циклогексадиенильные радикалы, ширина спектра 10 мТ) и бензильные радикалы. Для лецитина -кислородцентрированные радикалы (липидные пе-
рекисные радикалы типа ROO , ассиметричный синглет g|| = 2.030, g± = 2.005, ширина спектра 4.85 мТ, температурный интервал термической гибели радикалов 180-260 К [7, 13]).
Радикалы, образовавшиеся из лецитина и воды (в монокомпонентных системах), погибали при температурах 250-270 К и 95-110 К соответственно (рис. 1д). Необходимо отметить, что феноксиль-ные радикалы, образовавшиеся из ионола в процессе облучения при низких температурах (77 К), обладают достаточно высокой термической стабильностью. Количество парамагнитных центров уменьшалось слабо (снижение общего количества радикалов на 70% от исходного, по-видимому, за счет гибели Н-аддуктов) при размораживании образца от 77 до 300 К (рис. 1д). Разогрев (до ~200 К) облученного образца ионола приводил практически к полному доминированию в спектре феноксильных радикалов (рис. 1г.). При этом сигнал от
(а)
20 18 16 14 12 10 8 6 4 2
Н 40 мТ
100
150
200 т, к
250
300
350
Рис. 1. ЭПР-спектры (а, б, в, г) при 77 К и кривые термической гибели радикалов (д), образующихся в монокомпонентных системах (лед, лецитин, ионол) при облучении; □ - радикалы ОН* (спектр а, анизотропный дублет, g|| = 2.046, gj_ = 2.002, а(Н) = 4 мТ, ширина спектра 9.7 мТ); О - радикалы из лецитина (спектр б, ассиметричный синглет, = = 2.035, gJ_ = 2.007, ширина спектра 5.3 мТ); ▲ - радикалы из ионола (спектр в (77 К) - суммарный, спектр г (300 К) -феноксильный радикал, квартет, g = 2.004, а = 10.2, ширина спектра 10 мТ).
0
феноксильных радикалов при комнатной температуре наблюдали и через семь суток после облучения и размораживания ионола до комнатной температуры. С другой стороны, образовавшийся при облучении в многокомпонентных образцах (лецитин - ионол (рис. 2), вода - лецитин - ионол (рис. 3)) феноксильный радикал (спектр ЭПР аналогичен представленному на рис. 1г) исчезал уже при температурах 180-250 К. Облучение замороженной (77 К) водной дисперсии липосом с включенным в бислой акцептором (ионолом) приводило к образованию и накоплению набора радикалов, суммарный спектр ЭПР которых представлен на рис. 3 а. Анализ суммар
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.