== РАДИАЦИОННАЯ ГЕНЕТИКА =
УДК {57+61}::539.1.0:616—006:611.69:576.316:575.224.23:599.89
РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ КЛЕТОК КАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА САЬ51 ПО ПОКАЗАТЕЛЮ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ у-ИЗЛУЧЕНИЯ В МАЛЫХ ДОЗАХ
И ЕЕ МОДИФИКАЦИЯ
© 2015 г. А. В. Рзянина*, М. А. Коваленко, О. В. Комова, Т. А. Фадеева,
Н. Л. Шмакова, Е. А. Красавин
Объединенный институт ядерных исследований, Дубна
Исследованы количественные закономерности образования аберрантных клеток в культуре карциномы молочной железы человека САЬ51 при действии у-излучения в малых дозах (2—10 сГр), а также роль активных форм кислорода в индукции хромосомных аберраций. При этом были использованы различные модификаторы продукции активных форм кислорода (АФК), влияющие на уровень радиационно-индуцированного окислительного стресса. Показано, что выход аберрантных клеток увеличивается с ростом дозы облучения до 5 сГр, при которой этот показатель примерно вдвое превышает контрольный уровень. При дальнейшем увеличении дозы облучения радиочувствительность клеток резко снижается, что очевидно указывает на активацию цитопротекторных механизмов. Анализ влияния модификаторов продукции АФК на выход хромосомных аберраций, проведенный с учетом механизмов биологического действия модификаторов, позволил установить, что нелинейность зависимости доза—эффект при воздействии у-излучения в малых дозах в значительной степени определяет содержание АФК, генерируемых в клетке в ответ на действие радиации. Источником АФК являются дыхательная цепь митохондрий и система НАДФН-оксидазы, хотя роль последней требует более прямого подтверждения.
Хромосомные аберрации, ионизирующая радиация, малые дозы, активные формы кислорода. БО1: 10.7868/80869803115020113
По мере накопления данных, касающихся биологических эффектов действия ионизирующей радиации в малых дозах, становится все более очевидным, что метаболический стресс, а не повреждение ДНК вследствие ионизационных событий, может быть основным фактором, определяющим судьбу клеток после облучения в малых дозах. Ключевой процесс, влияющий на го-меостаз облученных клеток, — радиационно-ин-дуцированная генерация активных форм кислорода (АФК). Основным источником АФК в клетке являются митохондрии, в дыхательной цепи которых в процессе нормального метаболизма 2—3% молекулярного кислорода конвертируется
в супероксид-анион-радикал (O2 ). В норме ми-тохондриальный супероксид-анион и его производные играют важную регуляторную роль, обеспечивая поддержание окислительно-восстановительного статуса клеток. Однако было показано, что ионизирующая радиация способна вызывать резкое возрастание выхода митохондриального
* Адресат для корреспонденции:141980 Дубна, Московская обл., ОИЯИ, ЛРБ; тел.: (09621) 6-33-01; e-mail: rzjani-na@mail.ru.
супероксид-аниона, которое может сохраняться в клетках до 48 ч после воздействия (так называемый митохондриальный окислительный стресс) [1—6]. В результате взаимодействия супероксид-радикала с рядом клеточных субстратов образуется спектр вторичных АФК, среди которых наибольшую опасность для клетки представляют гидроксил-радикал и перекись водорода (перок-сид водорода).
Пусковым механизмом радиационно-индуци-рованной генерации АФК является открытие в мембране митохондрий специфических мегака-налов - пор митохондриальной проницаемости (ПМП), что приводит к падению митохондриаль-ного потенциала и резкому возрастанию продукции 02 в дыхательной цепи митохондрий [7—9]. Этот процесс получил название перехода митохондриальной проницаемости. Инициированный в одной или нескольких митохондриях, он может распространяться на весь внутриклеточный митохондриальный пул посредством передачи сигнала, природа которого до настоящего времени не установлена [7, 10, 11]. Генерация АФК при окислительном стрессе, вызванном различными факторами, в том числе ионизирующим из-
лучением, может приводить к патологической продукции АФК.
Вместе с тем, существует иной механизм генерации АФК в ответ на изменение клеточного метаболизма, получивший название митохондри-альных супероксид-анион вспышек — mitochondrial superoxide flick (mSOF) [12—14]. Они представляют собой квантальные всплески мито-хондриальной продукции супероксид-аниона, инициированные кратковременным открытием ПМП, и часто наблюдаются даже в покоящихся клетках. Частота их появления может быть модулирована метаболическими изменениями и окислительным стрессом. Как показано в работе [15], увеличение частоты возникновения mSOF является обратимым при кратковременном окислительном стрессе, что позволяет рассматривать их в качестве основного цитопротекторного механизма при нарушении клеточного гомеостаза. Вероятнее всего, они служат физиологическим сигналом для активации редокс-чувствительных сигнальных каскадов, направленных на защиту от окислительного стресса. Экспериментально продемонстрирована, в частности, защитная роль ERK протеинкиназы и NF-kB при окислительном стрессе и при действии радиации [17, 18]. Таким образом, конкурентное функционирование двух рассмотренных механизмов митохондриаль-ной генерации АФК в ответ на изменение окислительно-восстановительного статуса клетки может быть основным фактором, определяющим судьбу клетки при воздействии ионизирующей радиации в малых дозах.
Другим источником супероксид-аниона является система НАДФН-оксидазы. Именно ее активацию связывают с пролонгированной продукцией АФК при окислительном стрессе, инициированном действием различных факторов. Этот процесс требует также активации протеинкиназы р38 [16, 9].
Вовлечение АФК в эффекты действия ионизирующей радиации в малых дозах, в частности, такие как эффект свидетеля, радиоадаптивный ответ и нестабильность генома, было продемонстрировано в ряде работ [19—24]. Накоплено также много данных, свидетельствующих о том, что значительная часть генов, чья экспрессия модулируется при действии радиации в малых дозах, контролирует митохондриальные функции [25].
В данной работе исследовали роль радиацион-но-генерируемых АФК в индукции хромосомных аберраций в клетках карциномы молочной железы человека CAL 51 при действии у-излучения в дозах 2—10 сГр. Для этой цели были использованы модификаторы, влияющие на уровень окисли-
тельного стресса: циклоспорин А — ингибитор перехода митохондриальной проницаемости; SB203580 — ингибитор протеинкиназы p38, необходимой для активации пролонгированной продукции АФК НАДФ-оксидазой; антимицин А — ингибитор комплекса III дыхательной цепи митохондрий, широко известный как АФК-генератор в клетках; U126 — ингибитор протеинкиназы ERK1/2, выполняющей цитопротекторную роль при действии различных стрессовых факторов; TEMPOL — перехватчик супероксид-аниона.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Клетки карциномы молочной железы человека CAL51 инкубировали при 37°С в атмосфере 5%-го СО2. Для культивирования использовали питательную среду DMEM c добавлением 10%-ной фетальной сыворотки и 2 ммоль/л L-глутамина.
Клетки подвергали воздействию у-излучения 60Со на установке "Рокус-М" (Россия) с мощностью дозы 0.18 Гр/мин. Облучение проводили во флаконах при плотности клеточного монослоя ~70—80%, после чего культивировали клетки в течение 8 ч. Затем клетки фиксировали смесью метанола и ледяной уксусной кислоты (3 : 1), окрашивали орсеином и проводили анализ числа клеток с аберрациями хромосом анафазным методом. В каждом эксперименте на точку просчитывали 1000—1500 анафаз и определяли частоту аберрантных клеток, куда включались клетки с мостами и фрагментами.
Модификаторы добавляли до облучения в следующих концентрациях: циклоспорин А (CsA) — 1 мкмоль/л; U126 — 25 мкмоль/л ; TEMPOL — 10 ммоль/л; SB203580 — 10 мкмоль/л. Антимицин А (АтсА) в концентрации 1,5 мкг/мл добавляли сразу после облучения. Все реагенты были производства "Sigma" (США).
Определение количества фосфорилированной ERK проводили HTRF-методом с помощью набора реагентов Cellul'erk (Phospho-ERK1/2) согласно протоколу производителя "СзЬю" (США). Измерения проводили на микропланшетном ридере Synergy H1 (США).
На графиках зависимостей доза—эффект в качестве статистических погрешностей указаны среднеквадратичные отклонения. Достоверность различий в выходе аберрантных клеток при разных дозах облучения анализировали с помощью одностороннего дисперсионного анализа Крас-кела—Уоллиса.
Для оценки достоверности различий выхода аберрантных клеток в культурах, подвергшихся
м о н <0 ч м
л «
H «
ce
р р
(U VO
св
14 12 10
10 20 30 40 50 Доза, сГр
60
0123456789 10 Доза, сГр
-exp 1 exp 2 exp 3 exp 4 exp 5 exp 6 exp 7 exp 8 exp 9
Рис. 1. Дозовая зависимость частоты аберрантных клеток СЛЬ51 при действии у-излучения в диапазоне доз 2—50 сГр: а — усредненные данные 10 экспериментов; б — данные 9 экспериментов в диапазоне доз 2—10 сГр.
8
6
4
2
0
0
различному воздействию, вычисляли 90-, 95- и 99%-ный доверительные интервалы для разности между средними значениями этого показателя в соответствующих образцах. Если данные доверительные интервалы не включали в себя единицу, различия считали достоверными при данном уровне значимости [26]. Для расчетов использовали программу Epi Info™.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Установлено, что дозовые зависимости выхода аберрантных клеток CAL 51 по избранным показателям после облучения имеют сложный нелинейный характер (рис. 1). В области очень низких доз облучения, не превышающих 5 сГр, частота аберрантных клеток существенно превышает уровень, ожидаемый при простой экстраполяции эффектов, наблюдаемых при больших дозах облучения. Однако последующее увеличение дозы приводит к возрастанию радиорезистентности, что проявляется в виде снижения процента аберрантных клеток, который в некоторых случаях приближается к контрольному уровню. Хотя результаты варьировали от эксперимента к эксперименту, в каждом из них наблюдался характерный пик в области 5 сГр. Даже в случае, когда этот пик был наименее выраженным (рис. 1, б, exp5), процент аберрантных клеток при этой дозе (5.9%) статистически достоверно отличался от этого показателя в контроле (3.8%), как и при дозе 7 сГр (3.4%) (p = 0.0355).
Полученные данны
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.