РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2008, том 48, № 6, с. 698-704
^ МОЛЕКУЛЯРНАЯ
РАДИОБИОЛОГИЯ
УДК 591.484.3:599.323.4:577.2131.217:576.385:539.1.047
РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ СЕТЧАТКИ:
под действием y-излучения в сетчатке мышей формируются разрывы днк, увеличивается содержание
белка р53, СОПРОВОЖДАЕМЫЕ РЕПАРАЦИЕЙ ДНК И ОТСУТСТВИЕМ АПОПТОЗА КЛЕТОК
© 2008 г. М. Ю. Логинова1*, В. А. Тронов2' 3, Т. А. Белецкая1, Т. Б. Фельдман1' 3,
И. Г. Панова4, М. А. Островский1, 3
1 Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва 2 Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва 3 Лаборатория радиационной биологии Объединенного института ядерных исследований, Дубна 4 Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова, Москва
В ответ на у-излучение в дозе 14 Гр у мышей в ДНК сетчатки формируются одно- и двунитевые разрывы, которые эффективно репарируются. В течение репарации в клетках сетчатки наблюдается повышение уровня р53. Спустя 48-72 ч после облучения в ДНК сохраняется некоторое количество разрывов. Несмотря на увеличение содержания р53 и наличие в геноме балласта остаточных повреждений, в сетчатке не наблюдается резких деструктивных тканевых изменений и признаков апоптоза. Предполагается, что устойчивость сетчатки к апоптотическим сигналам связана с эффективной репарацией радиационных повреждений в транскрибируемой части генома дифференцированных клеток.
Сетчатка, ионизирующая радиация, разрывы ДНК, репарация, апоптоз, р53.
Апоптоз фоторецепторных клеток играет важную роль в дегенерации сетчатки, наблюдаемой при различных заболеваниях зрительных органов [1-3]. Дегенеративные процессы в сетчатке могут также вызываться внешними воздействиями, повреждающими ДНК (УФ, ионизирующая радиация, химические агенты) [4-6]. Развивающаяся сетчатка новорожденных мышей характеризуется высокой радиочувствительностью и склонностью к радиационно-индуцированному апоптозу. Было показано, что в ответ на радиационное воздействие в сетчатке новорожденных мышей активируется АТМ/р53-сигнальный путь, ведущий к апоптозу [7]. Согласно морфологическим показателям, сетчатка взрослых животных более радиоустойчива [8].
Анализ результатов многочисленных полетов человека в космос показал, что глаз, наряду с кожей, является самым дозоаккумулирующим органом [9]. Поэтому, несмотря на сравнительную радиоустойчивость сетчатки, у многих космонавтов наблюдается ранний катарактогенез и другие зрительные патологии [10]. Однако на сегодняшний день пусковые механизмы радиационно-инду-
*Адресат для корреспонденции: 119334 Москва, ул. Косыгина, 4, Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН; факс: (495) 137-41-04; e-mail: marina.loguino-va@mail.ru.
цированного патогенеза органа зрения не исследованы. Более того, практически не охарактеризованы система репарации ДНК и радиационно-индуцированный апоптоз клеток сетчатки. В данной работе мы исследовали ответ сетчатки после однократного воздействия у-излучения в дозе 14 Гр на мышей, включающий в себя повреждение ДНК, репарацию возникших повреждений, увеличение содержания генного регулятора р53 и апоптоз клеток сетчатки.
Результат показал, что в ответ на воздействие у-излучения в клетках сетчатки формируются одно- и двунитевые разрывы ДНК, которые эффективно репарируются со скоростью ниже, чем в делящихся клетках и даже в покоящихся лимфоцитах. В течение периода репарации в клетках наблюдается накопление р53. Спустя 48-72 ч в клетках сетчатки сохраняется некоторое количество разрывов ДНК. Однако, несмотря на повышенный уровень р53 и наличие в геноме балласта остаточных повреждений, в сетчатке не наблюдается деструктивных тканевых изменений и признаков апоптоза.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Животные. Исследования проводились на половозрелых мышах линии СВАхС57В1 (самках), в
возрасте 2.5 мес. Животных содержали в стандартных лабораторных условиях (22 ± 2°С, относительной влажности воздуха 60 ± 10% и 12-часовым световым периодом). Доступ к воде и коммерческому корму был свободным.
Условия облучения. Мышей подвергали общему воздействию у-излучения (60Со) на терапевтической у-установке "Рокус-М" (Объединенный институт ядерных исследований, г. Дубна), мощность поглощенной дозы 0.01 Гр/с.
Экспериментальные процедуры. Все процедуры с животными были осуществлены согласно положению Комитета по этике ИБХФ РАН от 17 сентября 2007 г.
После тотального однократного воздействия у-излучения в дозе 14 Гр, животных умерщвляли в парах хлороформа непосредственно после облучения и затем через 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72 и 84 ч. После энуклеации один глаз фиксировали в растворе Буэна для получения гистологических препаратов, а из второго выделяли сетчатку, которую помещали в охлажденный фосфатно-солевой буфер (ФСБ), рН 7.4, осторожно, используя пипетку, диспергировали и после центрифугирования в течение 5 мин при 400 g немедленно использовали в работе. Сетчатка является высокоспециализированной тканью, состоящей из стабильной популяции дифференцированных клеток. Важная особенность клеток сетчатки - неустойчивость во внешней среде - делает невозможными длительное манипулирование с клетками in vitro и использование прижизненных клеточных показателей апоптоза.
Морфологические исследования. Глаза, фиксированные в жидкости Буэна, отмывали в 70%-ном этаноле, проводили по стандартной методике через спирты восходящей крепости и ксилол, обрабатывали смесью спирт-ксилол и заливали в парафин. Парафиновые поперечные срезы толщиной 5 мкм на предметном стекле окрашивали гематоксилин-эозином и анализировали с помощью световой микроскопии. Морфометри-ческие измерения слоев сетчатки проводили с помощью окулярной линейки.
Вестерн-анализ р53. Сетчатку суспендировали в ФСБ, центрифугировали и клеточный осадок ресуспендировали в 100-150 мкл лизирующе-го буфера, содержащего 0.093 моль/л трис-HCl, pH 6.8, 23.2%-ный глицерин, 2.3%-ный ДСН, 23%-ный Р-меркаптоэтанол, 1:50 коктейль ингибиторов протеаз (Sigma). С целью деградации ДНК лизаты выдерживали на кипящей водяной бане в течение 5 мин, центрифугировали для осаждения капель, замораживали и хранили при -20°С до использования. Аликвоты лизатов, содержащие 80 мкг белка, подвергали электрофорезу в 12.5%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) при 100 В в течение 4.5 ч в камере для вертикаль-
ного электрофореза (Хеликон). Блот-перенос осуществляли на блоттере (Helicon Semi-Dry Transfer) в буфере для переноса (трис-глицино-вый буфер: 25 моль/л трис, 250 ммоль/л глицин и 20%-ный метанол. Для подавления неспецифического связывания антител мембраны обрабатывали 1%-ным бычьим сывороточным альбумином (БСА), растворенном в ФСБ-T (ФСБ и 0.1%-ный Тритон Х-100), в течение 2 ч при 23°С в ходе активного перемешивания. После отмывки в ФСБ-T мембраны инкубировали с первичным антителом к р53, разведение 1:2000 (Abcam, mouse monoclonal, ab26, 0.9 мг/мл) в течение ночи при 4°С. Мембрану трижды отмывали в ФСБ-T в течение 15 мин и инкубировали 2 ч при 23°С с конъю-гатом: вторичное антитело-пероксидаза хрена, разведение 1 : 400 (Abcam, mouse IgG antibody, ab6789-1, 1 мг/мл). Детекцию осуществляли, используя ECL-систему (Amersham Biosciences) и рентгеновскую пленку Retina.
Метод ДНК-комет. Использовали 2 модификации базового метода, описанного ранее [11]: щелочной вариант с рН 13.5, позволяющий определять разрывы ДНК и щелочелабильные сайты; нейтральный вариант с рН 8.2, детектирующий только двунитевые разрывы ДНК. Клетки иммобилизовали в тонком геле из низкоплавкой агаро-зы на поверхности предметного стекла. Слайды помещали в лизирующий раствор (2.5 моль/л NaCl, 100 ммоль/л Na2EDTA, 10 ммоль/л трис, 1%-ный Тритон X-100, 10%-ный диметилсуль-фоксид (ДМСО), pH 10). После инкубации в течение ночи при 10°С слайды помещали в электро-форетическую камеру, заполненную буфером, в котором выдерживали 40 мин в темноте в холодильнике. Для каждого варианта метода использовался свой электрофоретический буфер -300 ммоль/л NaOH, 1 ммоль/л Na2EDTA, 0.2%-ный ДМСО, pH 13.5 и ТАЕ-буфер рН 8.3. Для первого буфера напряжение 0.7 В^м, ток 170 мА в течение 21 мин. Для второго буфера напряжение 0.5 В^м, ток 15 мA, 40 мин. После электрофореза в первом буфере слайды нейтрализовали раствором 0.4 моль/л Трис, pH 7.4, ополаскивали водой и высушивали на воздухе. После электрофореза в нейтральном буфере слайды погружали в раствор 300 ммоль/л NaOH, 1 ммоль/л Na2EDTA, 0.2%-ный ДМСО, рН > 13 в темноте, 10 мин и нейтрализовали 0.4 моль/л трис, pH 7.4. Высушенные на воздухе слайды дегидратировали в холодном метаноле. Для микроскопии слайды окрашивали иодистым пропидием, растворенном в антифейде, 6 мкг/мл. Визуализировали кометы по флуоресценции: возбуждение 490 нм, эмиссия 540 нм. Накопленные изображения комет обрабатывали по программе CASP [12], вычисляя параметры момента хвоста комет (поврежденность ДНК), доли ДНК в хвосте и интегральной флуоресценции комет (содержание ДНК в клетке). Для каждого
А
Рис. 1. Микрофотографии (слева) и схематическое изображение комет (справа) с различным уровнем повреждения ДНК. А - кометы интактных клеток с неповрежденной ДНК; Б - кометы с небольшим количеством повреждений ДНК; В - кометы с большим количеством повреждений ДНК, кометы апоптотических клеток.
слайда строили распределение клеток по этим параметрам, находили средние значения и сравнивали получаемые распределения. По динамике удаления регистрируемых повреждений в процессе инкубации оценивали репарацию ДНК в клетках сетчатки in vivo. Показателем апоптотической гибели клеток служили кометы характерной каплевидной формы, наблюдаемые спустя более 24 ч после облучения животных (рис. 1).
Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета статистических программ Statistica 6 (США). Сравнение средних параметров проводили по критерию Стьюдента t.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Общее воздействие у-излучения на мышей не вызывает у них деструктивных изменений в сетчатке
Однократное воздействие у-излучения на мышей в дозе 14 Гр не приводило к морфологическим изменениям сетчатки в целом. Как видно из рис. 2, на всех сроках исследовани
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.