БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ
УДК 577.391:591.862:615
РАНОЗАЖИВЛЯЮЩИЕ СВОЙСТВА ХИТОЗАНА И ЕГО N-СУЛЬФОСУКЦИНОИЛПРОИЗВОДНЫХ
© 2010 г. Т. П. Алексеева*, А. А. Рахметова**, О. А. Богословская*, И. П. Ольховская*, А. Н. Левов***, А. В. Ильина***, В. П. Варламов***, Т. А. Байтукалов****, Н. Н. Глущенко*
*Институт энергетических проблем химической физики РАН, 119334Москва, Ленинский просп., 38, корп. 2 **Российский Университет дружбы народов, 117198Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6 ***Центр "Биоинженерия"РАН, 117312Москва, просп. 60-летия Октября, 7, корп. 1 **** Familiprix Lasalle, 9316, rue Airlie, Lasalle (Quebec) E-mail: nnglu@mail.ru Поступила в редакцию 16.06.2009 г.
Проведено сравнительное исследование ранозаживляющих свойств хитозана и его синтезированных производных в составе геля (МЦ—100) на модели экспериментальных полнослойных ран. Установлено, что N-сульфосукциноилпроизводные хитозана, введенные в состав геля в концентрации 0.05%, обладают наибольшей ранозаживляющей активностью по сравнению с другими производными хитозана и способствуют сокращению периода полузаживления ран в 2—3 раза по сравнению с контролем.
Высокомолекулярный полимер глюкозамина — хитозан и его производные обладают разнообразными биологическими свойствами, в том числе иммуностимулирующей, антибактериальной ранозаживляющей, антикоагулянтной и другими активностями (Jeon, Kim, 2001; Дрозд, Макаров, 2002; Park et al., 2004; Гамзазаде, 2005; Park et al., 2008; Weng et al., 2008) что создает предпосылки для разработки и создания фармацевтических препаратов на их основе. Используя способность хитозана подвергаться химическим превращениям с образованием разных производных, получены соединения с новыми биологическими свойствами (Быкова, Немцев, 2002; Alves, Mano, 2008). В связи с высокой потребностью в современных ранозаживляю-щих препаратах мы провели анализ литературы по использованию хитозанов, обладающих раноза-живляющими свойствами. Известно, что водный раствор высокомолекулярного хитозана, содержащий антисептики и стимуляторы регенеративных процессов (Линимент "Полимед" (Россия)) при наружном применении обладает ранозаживляющей и противоожоговой активностью, проявляет антибактериальные свойства при внесении в инфицированные и септические раны, трансформирует их течение и ускоряет различные стадии заживления раны, включая развитие грануляционной ткани, фибриллогенез и эпителизацию (Гафуров, Рассказов, 2008). Применение в качестве осмотически активного гидрогеля 10%-ного раствора аскорбата хи-тозана способствовало ускорению ранозаживления и сокращению срока госпитализации больных в среднем на 4-е сут (Карапетян и др., 2006). Показана
ранозаживляющая активность многих раневых покрытий: "Фолидерм-гель"ТМ (Россия) коллаген-хи-тозановый комплекс "Коллахит-Бол" (Россия) и хитозаны в виде пленок (Парамонов и др., 2006; Еремеев и др., 2008; Zhang et al., 2008; Dai et al., 2009). Ранозаживляющее действие гидрогелей, состоящих из N-карбоксиэтилхитозана и окисленного декстрана, показано на модели полнослойных ран (Weng et al., 2008). Применение N-карбоксибу-тилхитозана приводило к формированию кожной ткани и уменьшало аномальное заживление ран. Одним из преимуществ N-карбоксибутилхитозана при заживлении ран является обеспечение гелепо-добного слоя при контакте с раневыми жидкостями. Данный слой обеспечивает превосходную защиту недавно сформированных тканей от механических повреждений (Biagini et al., 1991).
Ранее проведенные нами исследования раноза-живляющей активности низкомолекулярных хи-тозанов (НМХ) показали высокую эффективность гелей, содержащих НМХ с молекулярной массой (М. м.) 72 кДа и 11 кДа со степенью дезацетилиро-вания (СД) 85% в обоих случаях. Период полузаживления ран уменьшался в два раза. Эффективность НМХ объясняется, в частности, их высокой антибактериальной активностью (Байтукалов и др., 2005).
Целью наших исследований являлось изучение ранозаживляющих свойств N-сульфосукциноил-производных хитозана на модели экспериментальных полнослойных ран.
Рис. 1. Общая формула производных хитозана, где Х и Y — заместители; п, т, р, q — индексы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали хитозаны с М. м. 56 и 200 кДа и СД 85 ± 3%, выпускаемые ЗАО "Биопрогресс" (Щелково).
Для получения производных хитозана использовали реагенты: малеиновый ангидрид и пиросуль-фит натрия (Fluka, Германия).
Степень дезацетилирования и замещения производных определяли аналитическими и спектральными методами (Hirai et al., 1991; Ильина, Варламов, 2003). М. м. хитозанов 56 и 200 кДа определяли вискозиметрическим методом (Wang et al., 1991), а для хитозана с М. м. 7 кДа методом высокоэффективной жидкостной гельпроникающей хроматографии как описано в работе (Лопатин и др., 2009).
Хитозаны вводили в концентрациях 0.5 и 0.05% в состав геля метилцеллюлозы (МЦ-100, 4%).
В опытах использовали взрослых мышей-самок линии SHK массой 18—20 г, которых получали из Центрального питомника лабораторных животных РАМН (Московская обл., д. Андреевка). Экспериментальные исследования на животных проводили в соответствии с инструкциями Института энергетических проблем химической физики РАН (1987) и Руководством по работе с лабораторными животными (Clark et al., 1996). Мышей делили на группы по 5—6 животных в каждой. Под эфирным наркозом на спине у мышей выстригали шерсть, по трафарету наносились контуры раны (круг площадью 60 мм2) и затем с помощью хирургических ножниц с закругленными концами удаляли лоскут кожи. Все раны оставались открытыми вплоть до окончания опыта. Мышам опытной группы сразу же после операции (в дальнейшем ежесуточно) на поверхность раны наносили 0.2 г исследуемого геля с производными хитозана. Мышам контрольной группы наносили 0.2 г основы геля без хитозана.
Контуры раны один раз в двое суток (или чаще) зарисовывали на прозрачные пленки, затем переносили контуры на бумагу и полученные отпечатки ран сканировали на сканере НР Scanjet G2710. Площадь раны рассчитывали с помощью компьютерной программы ImageJ 1.30 v. По кинетическим кривым изменения площадей ран в процессе регенерации рассчитывали периоды полузаживления ран. Достоверность различий между средними двух
групп оценивали по критерию Стьюдента. Различия считали достоверными прир < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Получение образцов хитозана и его производнъж. Нами были синтезированы производные хитозана, общая формула которых представлена на рис. 1, а структурные особенности отражены в табл. 1.
Соединение 1а и 11а—с получали из соединений I и II, соответственно, путем взаимодействия с избытком малеинового ангидрида при комнатной температуре в 0.2 М ацетатном буфере с последующим присоединением пиросульфита натрия при рН 4.5 и температуре 50°С как описано в работе (В^апоуа ег а1, 2004).
НМХ с М. м. 7 кДа и СД 98 ± 2%, был получен из высокомолекулярного хитозана (М. м. 200 кДа, СД 85 ± 2%) кислотным гидролизом 6 М НС1 при температуре 100°С в течение 3 ч по методике описанной в работе (ИкИопоу ег а1, 2006).
По данным 1НЯМР-спектроскопии степень дезацетилирования расчитана из соотношения интегралов протонов 2-С (3.14 мд) глюкозаминного звена и ацетильной группы (1.98 мд) М-ацетилглю-козаминного звена и составляла 85 ± 2% (соединения I и II) и 98 ± 2% (III).
Средневесовая М. м. образца III составляла = 7193, среднечисловая М. м. ММ = 5358, индекс полидисперсности (М^/ММ) !Р = 1.34.
Средневязкостную М. м. образцов хитозана I и II расчитывали по уравнению Марка—Хаувинка, используя коэффициенты, приведенные в работе (Gamzazade ег а1., 1985).
Характеристичекую вязкость хитозана определяли в вискозиметре Убеллоде при 25 ± 0.5°С в 0.2 М ацетате № и 2%-ной уксусной кислоте в соотношении 1 : 1 по объему.
Степень замещения по сульфогруппам в соединениях !а и ПЬ, Не определяли по результатам элементного анализа 2.0 ± 0.3%, и 7.0 ± 0.3%, 7.2 ± 0.3% соответственно.
Степень замещения соединения (На) составляла 85 ± 3%, отсутствие свободных аминогрупп подтверждено нингидриновым методом (Prochazkova ега1., 1999).
РАНОЗАЖИВЛЯЮЩИЕ СВОЙСТВА ХИТОЗАНА
405
Рис. 2. Экспериментальная полнослойная рана.
90 80
„ но
I 100 &
=к
о Я л ч
£3 70
св Я О
<ч &
о С
я
в
я
о ч с н о
60 50 40 30 20 10
6 8 Сутки
Рис. 3. Кинетические кривые изменения площади экспериментальных полнослойных ран при действии геля без хи-тозана (контроль (1)) и геля с НМХ (СД 85%) в концентрации 0.05%) (2).
Регенерирующие свойства производньх хитозана. Исследование ранозаживляющих свойств полученных нами производных хитозана в составе геля проводили на модели экспериментальных полнослойных ран (Байтукалов и др., 2005) (рис. 2).
На рис. 3 представлены кинетические кривые изменения площади ран при лечении гелем с НМХ (СД 85%, 56 кДа) в концентрации 0.05% и при лечении гелем без хитозана (контроль).
Видно, что первые трое суток характеризуются периодом интенсивного сокращения площади ран как в контрольной, так и опытной группе (при действии геля с НМХ СД 85%). Однако скорость уменьшения площади ран при действии геля с НМХ СД 85% выше, чем в контрольной группе. Хотя полное заживление ран в обеих группах происходит практически одинаково на 12—14-е сут после нанесения экспериментальных ран, период полуза-
о
р
о
д
о
С
« св
Я Д
I ^
^ се" М о о о
ч ^ о ^
6
6
0 0
сч
0 0
сч
0 0
сч
0 0
сч
л
5
н
13
о
о %
се 00
О т
б? О О
и
я
0
1
с^
я
о о о я £
о
б? О
о
и
я
0
1
с^
я
о о о я £
о
б? О
о
и
я
0
1
я
о о о я £
X
Я я я я
о о о о
о о о 0 1 о
о о о
1 1 £ о 1
я я я
о о о
я 53
О О о о
о о о о
о о о о
я я я я
£ £ £ £
о ^ и
я
се *
р
о
д
о
С
I °
оо о с п
се Я се со
о н
о
и
Я
се <ч
СО
се
я
о
СО
се
р
ю О
Я
се
СО
о н
и
X
чо
~ сч о сч
Й л
я
се
СО
о н
и
X
ч
и
о я
и Я
£ о
о
-е
л
£ о
оо о
Й л
о оо
Й л
я
се
СО
о н
и
X
~ сч о сч
й л
я
се
СО
о н
и
X
ч
и
о я
и Я
£ о
о
-е
л
£ о
■Л 00
06
й л
я
се
СО
о н
и
X
Ч
и
О
я
и Я
о
о
-е
л
£ о
в 11
„ сг 00 „ сл о
й л
я
се
СО
о н
и
X
Таблица 2. Периоды полузаживле
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.