ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 4, с. 582-591
УДК 581.1
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ И ТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ КАДМИЯ И СВИНЦА
НА КОРНИ КУКУРУЗЫ
© 2004 г. И. В. Серегин, Л. К. Шпигун*, В. Б. Иванов
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва * Институт общей и неорганической химии им. Н. С. Курнакова Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 28.02.2003 г.
Двухдневные проростки кукурузы (Zea mays L.) инкубировали на растворах нитратов Cd и Pb в концентрациях, ингибирующих рост корня за вторые сутки примерно на 50% (10-4 и 10-3 М соответственно) (LCso) или полностью останавливающих рост главного корня через сутки (5 х 10-4 и 10-2 М соответственно) (LC). Содержание Cd и Pb определяли с помощью анодной инверсионной вольтам-перометрии в проточно-инжекционной системе и гистохимическим методом. При LC50 Cd и Pb гис-тохимически выявлялись в апексе во всех тканях корня, в то время как в зоне корневых волосков они накапливались преимущественно в апопласте ризодермы и коры, и в меньшей степени в проводящих тканях и клетках паренхимы, окружающей сосуды метаксилемы. Содержание Cd и Pb в пе-рицикле было незначительным, что может быть одной из причин устойчивости ветвления корня к их действию. При LC Cd и Pb были обнаружены в апопласте всех тканей корня, что согласуется с практически полным ингибированием роста и ветвления корня. Независимо от концентрации в растворе, содержание металлов в апикальном участке корня было выше, чем в базальном. Гибель клеток под действием Cd и Pb оценивали с помощью проционовых красителей. При LC отмирали клетки корневого чехлика, меристемы, а также клетки ризодермы и наружней коры апикального участка корня. При LC50 погибали только клетки ризодермы апикального участка. Проникновение Cd и Pb через эндодермальный барьер при LC свидетельствует о барьерной роли поясков Каспари и плазмалеммы эндодермы, регулирующих поступление этих металлов в центральный цилиндр при меньших концентрациях. Сделан вывод о функционировании одних и тех же барьеров для транспорта Cd и Pb по тканям корня.
Zea mays - кадмий - свинец - апопласт - эндодерма - токсичность - корень
Среди тяжелых металлов, не являющихся необходимыми для растений и животных, Сё и РЬ являются наиболее распространенными. Поступая главным образом через корневую систему, эти металлы накапливаются в различных тканях и органах растений. Большинство видов растений относятся к группе так называемых "исключите-лей", накапливающих тяжелые металлы в подземных органах [1]. Считается установленным, что ограниченное поступление Сё и РЬ в побеги является результатом барьерной роли эндодермы корня, пояски Каспари которой препятствуют их поступлению в центральный цилиндр [2-6]. Однако являются ли пояски Каспари единственной причиной ограниченного транспорта Сё и РЬ че-
Сокращения: ЬС - концентрация соли, вызывающая остановку роста корня в течение первых суток; ЬС50 - концентрация соли, вызывающая приблизительно 50%-ное ингиби-рование роста корня за двое суток инкубации. Адрес для корреспонденции: Иванов Виктор Борисович. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 07 (095) 977-80-18; электронная почта: ivanov@ippras.ru
рез эндодерму в ткани центрального цилиндра [2-9], остается неясным.
Передвижение Сё и РЬ в радиальном направлении осуществляется главным образом по апопла-сту. Однако на корнях лука [2] и гипокотилях салата [9] была показана возможность и симпласт-ного транспорта РЬ.
Поступая внутрь любой клетки даже в небольших количествах, тяжелые металлы оказывают токсическое действие на самые разнообразные процессы. Они ингибируют активность большинства ферментов, нарушают минеральное питание и водный режим, изменяют гормональный баланс и структуру мембран, вследствие чего снижается активность многих физиологических процессов, а при высоких концентрациях тяжелых металлов клетки могут погибнуть [10-11]. В основе токсического действия металлов лежит их связывание с функциональными группами, в особенности с БИ-группами, которые определяют активность большого числа различных ферментов. Степень токсичности разных металлов коррелирует с прочностью их связи с БИ-группами [12]. Изучение влияния на рост корня различных тяжелых металлов показало, что несмотря на то, что от-
дельные металлы различаются по своей токсичности, существуют общие закономерности их действия: узкий диапазон действующих концентраций, отсутствие существенного усиления эффекта со временем, а также устойчивость ветвления корня на фоне сильного ингибирования роста главного корня [12].
Задачей настоящей работы было сравнить распределение Cd и Pb по тканям в различных участках корня, а также по отмиранию клеток выявить ткани и участки корня, наиболее чувствительные к действию этих металлов.
МЕТОДИКА
Выращивание и обработка растений растворами тяжелых металлов. Семена кукурузы (Zea mays L. сорт Диамант), простерилизованные в течение 20 мин формалином, проращивали на смоченной дистиллированной водой фильтровальной бумаге в течение 2 сут в темноте при 27°С. Проростки с длиной главного корня 20 - 30 мм пересаживали в чашки Петри диаметром 150 мм на фильтровальную бумагу, смоченную растворами Cd(NO3)2 ■ 4H2O и Pb(NO3)2 (ч.д.а), рН - 6.0, в концентрациях, ингибирующих рост главного корня примерно на 50% за двое суток (LC50) (10-4 и 10-3 М соответственно) или останавливающих рост главного корня в течение первых суток (LC) (5 х 10-4 и 10-2 М соответственно) [12]. Проростки выдерживали в темном термостате при температуре 27°С в течение двух суток.
Гистохимический анализ распределения Cd и Pb.
Определение Cd и Pb проводили с помощью разработанного нами метода, в основе которого лежит способность дитизона образовывать окрашенные комплексы с этими металлами [5]. Поперечные срезы корней, инкубированных на растворах солей металлов в течение 1, 24 и 48 ч, помещали на предметное стекло в раствор дитизона (0.5 мг/мл) в смеси ацетон : дистиллированная вода (3 : 1), к 6 мл которого добавляли 1-2 капли ледяной уксусной кислоты для повышения чувствительности реакции. Локализацию металлов определяли по красному окрашиванию тканей. Распределение Cd и Pb в различных участках корня оценивали как на поперечных срезах, сделанных на разном расстоянии от кончика корня, так и на интактных корнях, обработанных в течение нескольких минут раствором дитизона. Гистохимические исследования были проведены более 10 раз и дали сходные результаты.
Количественное определение Pb. Содержание Pb определяли в побегах и разных участках корней (базальном - 10 мм от зерновки и апикальном -10 мм от кончика корня). Побеги и участки корней взвешивали и высушивали в сушильном шкафу до постоянного веса при 80°С в течение 24 ч.
Анализируемые образцы тщательно измельчали (до частиц размером около 40 мкм) в агатовой ступке. 0.1-0.3 г измельченного и высушенного материала помещали в колбу Эрленмейера емкостью 50 мл и подвергали мокрому озолению в смеси 60%-ной НШ3 и 70%-ной НС104 (1 : 1, по 2 мл смеси на 0.1 г пробы) при постепенном нагревании до 150-170°С. В случае образования большого осадка, массу переносили в платиновую чашку и выпаривали досуха, а сухой остаток растворяли в 2%-ной НК03. После охлаждения полученных растворов их переносили в мерные колбы объемом 50 мл, которые доводили до метки бидистиллиро-ванной водой. Далее аликвоту каждой пробы (10 мл) анализировали на содержание РЬ методом анодной инверсионной вольтамперометрии в про-точно-инжекционной системе [13]. При этом использовали трехэлектродную проточную электролитическую ячейку, содержащую ртутно-графито-вый рабочий электрод, хлор-серебряный электрод сравнения и вспомогательный платиновый электрод. Измерения проводили с помощью вольтампе-рометрического анализатора Экотест-ВА (Россия) и проточно-инжекционного анализатора 5020 Тека-тор (Швеция). Потенциал накопления металла на электроде поддерживали равным -1.0 В, время накопления в зависимости от концентрации варьировали в пределах 30-180 с, скорость развертки потенциала от -1.0 до +0.1 В составляла 50 мВ/с. Концентрацию металлов определяли методом стандартных добавок с относительной погрешностью 10-12%. Относительное стандартное отклонение содержания РЬ не превышало 5% (п = 4, Р = 0.95).
Тестирование отмирания клеток под воздействием Cd и РЬ с помощью проционовых красителей. Метод основан на том, что окрашенный кислотный радикал проционовых красителей не проникает в живые клетки и окрашивает только мертвые. В отличие от других кислотных красителей, проционовые красители образуют с белками прочные ковалентные связи, которые не разрушаются в процессе приготовления постоянных препаратов [14, 15].
Для выявления отмерших клеток корней проростки инкубировали на растворах солей тяжелых металлов в течение 24 ч, после чего корни погружали в 0.1%-ный раствор проционового ярко-голубого (ЯБ) в водопроводной воде на 2.5 ч при постоянной температуре 22°С. Затем апикальные участки корней (около 15 мм) фиксировали в смеси Бродского (формалин : 96%-ный этанол : ледяная уксусная кислота в соотношении 10 : 3 : 1) [16] в течение 1 ч, промывали 96%-ным этиловым спиртом и оставляли на несколько недель в 70%-ном спирте.
Для приготовления постоянных препаратов фиксированные корни заключали в парафин,
Таблица 1. Распределение Cd и Pb по тканям корня
Ткань
Концентрация тяжелых металлов
LC
Время инкубации, ч
LC
50
1 24 48 1 24 48
Зона корневых волосков
Ризодерма + ++ +++ + + ++
Наружная кора + ++ +++ + + ++
Внутренняя кора - ++ +++ - + +
Эндодерма - + ++ - +/- +
Перицикл - + ++ - - +/-
Проводящие ткани - + ++ - - +/-
Обкладка ксилемы - + ++ - - +
Стеллярная паренхима - +/- ++ - - -
Апикальный участок корня
Покоящийся центр - + + - +/- +/-
Меристематические ткани - ++ ++ - + +
Корневой чехлик - ++ ++ - + ++
Примечание. ЬС - полная остановка роста через первые сутки инкубации (5 х 10-4 Сё(К03)2 или 10 2 М РЬ(К03)2); ЬС50 - приблизительно 50%-ное ингибирование роста корня за двое суток инкубации (10-4 Сё(К03)2 или 10-3 М РЬ(Ш3)2). +++ - оч
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.