научная статья по теме РАСШИРЕНИЕ НАБОРА МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЕРОВ С ЦЕЛЬЮ ПОВЫШЕНИЯ ТОЧНОСТИ ИДЕНТИФИКАЦИИ КЕТЫ (ONCORHYNCHUS KETA WALBAUM) Биология

Текст научной статьи на тему «РАСШИРЕНИЕ НАБОРА МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЕРОВ С ЦЕЛЬЮ ПОВЫШЕНИЯ ТОЧНОСТИ ИДЕНТИФИКАЦИИ КЕТЫ (ONCORHYNCHUS KETA WALBAUM)»

ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ

УДК 575.174.015.3:597.5

РАСШИРЕНИЕ НАБОРА МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЕРОВ С ЦЕЛЬЮ ПОВЫШЕНИЯ ТОЧНОСТИ ИДЕНТИФИКАЦИИ КЕТЫ (Oncorhynchus keta Walbaum)

© 2011 г. П. К. Афанасьев, Г. А. Рубцова, М. В. Шитова, Е. Г. Шайхаев, Л. А. Животовский

Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва 119991

e-mail: ovrcr@inbox.ru Поступила в редакцию 06.06.2011 г.

В лаборатории генетических проблем идентификации Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН был разработан набор из 10 микросателлитных локусов, позволяющий достаточно точно идентифицировать особей кеты из географически удаленных группировок, но недостаточно точный для идентификации особей из близкорасположенных бассейнов. Целью данной работы было увеличить разрешающую способность метода с помощью расширения имеющегося набора микро-сателлитных локусов. В статье представлено описание работы по отработке дополнительных мик-росателлитных локусов кеты и оценке изменения степени идентификации с увеличением числа используемых микросателлитных маркеров. Было показано, что точность идентификации стабильно увеличивается при расширении набора используемых микросателлитных маркеров.

Кета является ценным промысловым видом лососевых рыб. Она широко распространена по всей северной части Тихого океана и нерестится в реках обоих континентов: азиатского и американского. На азиатской части нерестового ареала кета занимает второе место после горбуши по мощности подходов. Ежегодный вылов кеты на российском Дальнем Востоке составляет в среднем около 60000 т [1]. Нерест у кеты в основном происходит в возрасте от 4 до 6 лет, на российском Дальнем Востоке — по преимуществу в реках Сахалина, Южных Курил, охотоморского побережья материка и Камчатки [2].

Пополнение запасов кеты идет как путем естественного воспроизводства, так и за счет искусственного разведения на лососевых рыбоводных заводах (ЛРЗ). В настоящий период времени в странах Северной Пацифики действуют свыше 800 лососевых рыбоводных заводов, среди которых многие воспроизводят кету [3]. Так, в Японии на о. Хоккайдо проводится интенсивное искусственное разведение с целью поддержания промысла кеты, выпуск здесь достигает 1 миллиарда молоди кеты [4]. В последнее время, прежде всего благодаря изменениям условий хозяйствования, все больший интерес к разведению кеты проявляется и в России [5].

Параллельно с увеличением объемов промысла и искусственным разведением возникают проблемы определения принадлежности отдельных рыб или выборок к тем или иным нерестовым группировкам. Это могут быть вопросы, связанные с необходимостью определения популяцион-ной принадлежности рыб при вылове на путях

миграции, выявлении сезонных и экологических рас, а также спорные вопросы о происхождении уловов, при экологической сертификации морского промысла [6]. С каждым годом необходимость решения этих проблем приобретает всё большую актуальность. Для их решения встает задача выбора наиболее подходящих для этого генетических маркеров, способных обеспечить достаточную точность идентификации отдельных рыб или выборок по их популяционной принадлежности. На данный момент в лаборатории генетических проблем идентификации Института общей генетики им Н.И. Вавилова РАН используется набор из десяти микросателлитных локусов [7], надежно дифференцирующий региональные группировки [8], а также популяции в пределах регионов [9]. Для особей, принадлежащих к близкорасположенным группировкам, точность идентификации недостаточна. В связи с этим существует необходимость увеличить разрешающую способность данного метода.

Цель работы — увеличить точность идентификации особей из географически близких группировок. Для её решения была поставлена задача расширить уже существующий набор микроса-теллитных маркеров и оценить изменение точности идентификации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Нами было подобрано и апробировано более 70 праймеров. В табл. 1 представлены локусы, праймеры к которым были апробированы в ходе работы, и локусы, выбранные для дальнейшего

Таблица 1. Список локусов, апробированных в ходе работы

Локус ПЦР-продукт Размер продукта, пн Полиморфизм Источник информации о последовательности праймеров

0my1011 + 230-300 P [14]

0ts1 + >250 P [11]

0ts2.1 - - - [14]

Ots 103 + >200 P »

Ssa419 - - - »

0ke8 - - - »

One 100 + >200 P [18]

One 104* + 117-237 P [14]

One 106 + 200-300 P [18]

0ne114 + >200 P [14]

One115 + >400 P [18]

0ki8 - - - [23]

0ki9 + <100 М »

0ki10* + 117-235 P »

Oki 16 + >450 - »

Oki 19 + <100 M »

0ki21 - - - »

0ki23* + 135-171 P [14]

Oki 100 + 160-180 P »

One 102 + 200-300 P »

0tsG85* + 122-210 P [24]

0tsG68 - - - [14]

0ki3 + <100 M [23]

Oki 18 + <100 M »

0go8 - - - [16]

Oki 11 - - - [23]

0ne110 + >250 M [18]

0ke4 + >400 - [14]

0ts211 - - - [13]

0MM1070 + 100-250 P [19]

Ots 102* + 155-211 P [15]

0ts2 + 243-257 P [11]

0MM1037* + 168-188 P [20]

* Локусы, выбранные для дальнейшей работы.

исследования. Критериями отбора было наличие полиморфизма по этому локусу, а также размер продуктов амплификации, подходящий для анализа в акриламидном геле. Всего было опробовано 32 микросателлитных локуса, описанных ранее, из которых были выбраны 6 полиморфных, наиболее удобных для дальнейшей работы. Для трех из выбранных локусов были разработаны новые праймеры с целью уменьшения размера ПЦР-продуктов. В табл. 2, 3 представлены локу-

сы, выбранные для дальнейшей работы, с представленными модифицированными праймерами, и локусы использовавшиеся ранее.

В ходе работы использовали способ выделения препаратов ДНК с набором реагентов Diatom DNA Prep 200 фирмы ООО "Лаборатория изоген" (Россия).

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в амплификаторе Veriti фирмы "Applied Biosystems" (США). Использовали готовые лиофили-

Таблица 2. Список локусов, выбранных для дальнейшей работы

Локус T°C Размер продукта ПЦР, пн Повтор Праймеры(5'-3') Theta-P (показатель степени дифференциации)

Oki23 50 135-171 (TGTC)B F-cat-cac-acg-att-cct-aga-gtg-a R-cct-cat-cca-cgt-tag-cat-ca 0.05

0ki10G 60 117-235 (TGTC)B F-gag-tgc-tgg-aca-gat-tgg-att R-ggt-tgg-acc-tca-tgg-tga-a 0.03

0ne104G 54 117-237 (TCTA)B F-gct-act-aca-atc-cta-gtc-tgt-gat-t R-cat-ctt-ctt-cag-tgg-ctg-tag-at 0.01

Ots 102 58 155-211 (TCTG)B F-gga-tcc-aat-aag-gag-tga-tat-agt-ag R-tat-ccc-ctt-tac-cat-ttc-cct-tgc-ta 0.06

0tsg85 60 122-210 (ATAG)B F-agc-act-gac-tta-ata-tac-aca-ctg-a R-gct-tac-aac-tca-tta-ttt-gga-tgt-tg 0.03

0mm1037G 60 168-188 (GAAA)„ F-gaa-cgg-cga-ctg-gat-tta-ata-ct R-ccg-ctc-acc-ctc-gtc-tct-taa 0.07

Таблица 3. Список отработанных ранее локусов

Локус T°C Размер ПЦР-продукта, пн Повтор Источник информации о последовательности праймеров Theta-P (показатель степени дифференциации)

Ssa20.19 60 76-90 (AC/TG)n [21] 0.17

0ts3 48 74-118 (TC)n [22] 0.05

0go2 58 178-202 (GA) n [17] 0.04

0ne103 56 111-243 (ATCT)nN16(ATCT)n [18] 0.02

0ki1-1 54 176-276 (CTGT)n [23] 0.02

0ki 1-2 54 90-102 (CTGT)n » 0.16

0ke3 56 210-327 (TCCCTCTCGTCTC)n [12] 0.08

0ke11 54 85-103 (CA)nGA(CA)n » 0.04

Ssa197 56 113-133 (GT)nC(TG)nTC(TG)nA(GTGA)n [16] 0.03

0ne109 56 111-191 (TAGA)n [18] 0.04

зированные смеси для ПЦР GenePakPCR Core фирмы ООО "Лаборатория изоген" (Россия). Инкубационная смесь объемом 20 мкл содержала буфер для ПЦР, 200 мкМ каждого дезоксирибонук-леотида (dTTP, dCTP, dATP, dGTP), 1.5 мМ MgCl2 , 50 нг геномной ДНК и специфические праймеры концентрацией 0.1—0.5 мкМ. Реакцию начинали процессом денатурации в течение 1 мин при 94°С, затем проводили 35 циклов, включающих 1 мин денатурации ДНК-матрицы при температуре 94°С, 30 с отжига праймеров при Х°С и синтез новых цепей в течение 30 с при 72°С; затем следовала

элонгация 4 мин при 72°С (Х°С — температура отжига для индивидуальной пары праймеров дана в табл. 2).

Аликвоты амплифицированных продуктов разделяли в вертикальном блоке 6%-ного неденатури-рующего полиакриламидного геля в 0.5х ТВЕ буфере рН 8.0 [10] при 300 В в течение 2—5 ч.

Полученные электрофореграммы визуализировали путем окрашивания бромистым этидием и просмотра на ультрахемископе.

Таблица 4. Список использованных в работе выборок кеты

№ п.п. Место взятия выборки Дата взятия выборки Число исследованных рыб

1 оз. Сопочное (руч. Порожистый) 2005 г. 50

2 оз.Сопочное 2005 г. 50

3 р. Курилка (устье) 2006 г. 50

4 р. Курилка (устье) 2008 г. 50

5 р. Рыбацкая 2006 г. 50

6 р. Рыбацкая 2008 г. 50

7 р. Рейдовка (устье) 2006 г. 50

8 р. Илюшинка 2005 г. 50

9 оз. Танковое 2006 г. 50

10 Калининский ЛРЗ 2003 г. 50

11 Охотский ЛРЗ 2004 г. 50

12 Адо-Тымовский ЛРЗ 2003 г. 50

13 р. Камчатка 2007 г. 50

В качестве маркера длин фрагментов использовали ДНК плазмиды pBr322, обработанную ре-стриктазой Hpall. Размеры аллелей по каждому локусу определяли с использованием программы 1D Image Analysis Software Version 3.5 фирмы "Кодак" (в табл. 2 приведены размеры выявленных аллелей).

Материалом для оценки изменения точности идентификации по исследуемым локусам были выборки кеты российского Дальнего Востока. Список выборок представлен в табл. 4, места взятия проб обозначены на рис. 1.

Точность идентификации в данной работе — это доля рыб, которых программа (GenClass) по критерию максимальной вероятности относит к тому региону (району, реке, бассейну, ЛРЗ), из которого они были выловлены. Ошибка идентификации — это величина, дополняющая значение точности идентификации до 100%.

Образцы каждой из выборок генотипировали по микросателлитным маркерам. Полученные данные по микросателлитной изменчивости обрабатывали в программах: GDA, GenClass 2.0, Statistica 6.0 и Structure. При определении вероятности принадлежности образца к популяциям по

программе GenClass исследуемый образец исключали из общей базы данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты, полученные в ходе этой работы, в общем подтвердили высказанное предположение о необходимости расширения набора маркеров для увеличения точности идентификации.

Точность идентификации кеты при использовании 16 микросателлитных локусов была стабильно выше той, которая характеризовала имеющийся набор из 10 ми

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком