НЕЙРОХИМИЯ, 2012, том 29, № 1, с. 23-27
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.152.3
РАЗЛИЧНАЯ РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗ ЖИВОТНЫХ
© 2012 г. Е. В. Розенгарт*, Н. Е. Басова, В. С. Сааков
Учреждение Российской академии наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН,
Санкт-Петербург
В настоящем исследовании впервые сопоставлены и подробно проанализированы данные по чувствительности 4 препаратов ацетилхолинэстераз человека, кролика, мыши и голов комнатной мухи к действию специально синтезированной группы хинолизидиновых фосфорорганических ингибиторов, молекулы которых содержали как изомерные неразветвленные и разветвленные алкоксиль-ные производные фосфорильной группировки, так и эпимерные лупининовые и эпилупининовые производные отщепляющейся группы. Выявленные различия в антиферментных свойствах тестированных соединений позволили обнаружить ряд специфических ингибиторов разных ацетилхо-линэстераз. Тем самым показана различная реакционная способность ацетилхолинэстераз разных животных.
Ключевые слова: ацетилхолинэстеразы разных животных, фосфорорганические ингибиторы, специфические ингибиторы.
ВВЕДЕНИЕ
Ключевым ферментом холинергической нервной передачи является ацетихолинэстераза (аце-тилхолин ацетилгидролаза, КФ 3.1.1.7, АХЭ) [1], осуществляющая катализ гидролиза сложно-эфирной связи в молекуле медиатора ацетилхо-лина [2—4]. Фактически, из всего многочисленного ферментного семейства холинэстераз, возникшего благодаря выраженной их тканевой и видовой специфичности, только АХЭ имеет четко определенную физиологическую функцию [2, 3]. Однако вопрос о видовой специфичности АХЭ остается по существу открытым, хотя в литературе есть указания об определенных различиях в субстратной и ингибиторной специфичности АХЭ разных животных [3, 4]. Кроме того, известно, что в организме млекопитающих АХЭ содержится как в нервной ткани, так и в эритроцитах [2—4], и нами была показана одинаковая реакционная способность АХЭ мозга и эритроцитов [4—6]. Для сравнения энзимологических свойств АХЭ разных животных особый интерес представляют фосфорор-ганические ингибиторы (ФОИ), в основе антихолинэстеразного действия которых лежит процесс фосфорилирования гидроксила серина каталитической триады активного центра, что дает возможность использовать эти ингибиторы для количественной оценки реакционной способности различных АХЭ [2—4]. И, конечно, важный блок информации дает такое варьирование строе-
* Адресат для корреспонденции: 194223, Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44; тел.(812) 552-31-88; e-mail: roz@iephb.ru.
ния молекулы ФОИ, которое не сказалось бы на их фосфорилирующей активности, что дает возможность прямого сопоставления структуры ингибиторов с их антихолинэстеразной эффективностью. В этой связи мы обратили внимание на группу ФОИ — производных лупинина и его эпимера эпилупинина [7]. Лупинин представляет собой 1-оксиметилхинолизидин с аксиальной оксиме-тильной группой, а эпилупинин — более стабильный изомер лупинина с экваториальной оксиме-тильной группой [7—9]. Эти ФОИ были в разное время изучены в качестве ингибиторов холинэсте-раз различных млекопитающих и членистоногих [10-12].
В настоящем исследовании из большого числа алкалоидных ФОИ [7] мы впервые вычленили группу лупининовых (соед. I—VII) и эпилупини-новых (соед. "УШ—Х!У) производных, суммировали данные по их антиферментному действию и подвергли их детальному анализу в координатах "структура—эффективность". В чем уникальность тестированной группировки ФОИ? Во-первых, структурные изменения в молекуле ФОИ из-за их пространственной удаленности от реакционного центра (атом фосфора фосфорильной группировки) не влияют на фосфорилирующую способность ингибитора, что, как отмечено выше, дает возможность прямого сопоставления структуры ФОИ с их антихолинэстеразной активностью (такие примеры подробно рассмотрены в [3, 4]). Во-вторых, сравнение эффективности производных эпимеров (лупинина и эпилупинина) позволяет оценить влияние взаимного расположения хинолизидино-
24
POЗЕHГAPТ и др.
вого бицикла и фосфорильной группировки молекулы ингибитора. В-третьих, структурные изменения касаются как фосфорильной группы, так и отщепляющейся группировки молекулы ФОИ. В-четвертых, целенаправленные вариации строения алкоксильных радикалов фосфорильной группировки дают возможность сопоставления как гомологических рядов, так и изомерных пар неразветвленных и разветвленных алкоксильных производных, что, как не странно, столь детально ранее не проводилось [2—4].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве источников ферментов были исследованы частично очищенные препараты АХЭ
(RO2)P(O)SCH2-4—
Антихолинэстеразную эффективность ФОИ оценивали по величине бимолекулярной константы скорости реакции М-1 мин-1 [2—4].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В энзимологии холинэстераз существуют два "реперных" фермента, являющихся представителями двух номинаций в Классификации ферментов [1]: ацетилхолин ацетилгидролаза, КФ 3.1.1.7, и ацилхолин ацилгидролаза, КФ 3.1.1.8, — это АХЭ эритроцитов человека и БХЭ сыворотки крови лошади, поэтому данные по БХЭ приводятся в табл. 1 наряду с препаратами АХЭ. Как видно из данных табл. 1, тестированные хинолизидиновые ФОИ проявили себя как выраженные антихо-линэстеразные агенты с чрезвычайно широкими различиями величин активности по отношению к изученным ферментам. Так, например, эффективность соед. I по отношению к АХЭ голов комнатной мухи была на 4 порядка выше, чем по отношению к АХЭ млекопитающих. Следует отметить, что этот препарат АХЭ вообще оказался более чувствительным к тестированным ФОИ по сравнению с ХЭ млекопитающих. Хинолизидиновые ФОИ оказались более эффективными ингибиторами БХЭ сыворотки крови лошади, чем АХЭ млекопитающих. В несколько меньшей степени наблюдались различия в реакционной способности и
эритроцитов человека Homo sapiens и бутирилхо-линэстеразы сыворотки крови лошади Equus cabal-lus (ацилхолин-ацилгидролаза, КФ 3.1.1.8, БXЭ), а также препараты AXЭ эритроцитов кролика, Oryc-tolagus cuniculus, AXЭ мозга мыши Mus musculus, AXЭ голов комнатной мухи Musca domestica [10—12]. Ферментативную активность XЭ определяли колориметрическим методом Эллманна [13].
В качестве ФOИ были исследованы следующие производные лупинина (соед. I—VII) и эпилупи-нина (соед. VIII—XIV), синтезированные A.A. Aбду-вахабовым и Д.Н. Далимовым в Институте биоорганической химии им. A.Q Садыкова Aкадемии наук Узбекистана [7]:
между препаратами АХЭ млекопитающих. Как и следовало ожидать, очень важную роль играют варьирование структуры ФОИ: выше мы отмечали, что эти изменения целенаправленно касались как строения фосфорильной группы, так и отщепляющейся части молекулы ФОИ.
Данные табл. 1 позволяют выявить эффект от изменения строения алкоксильных радикалов при центральном атоме фосфора: в каждом ряду ФОИ сгуппированы соединения с изменяющейся длиной алкоксила от этила до амила и разной изо-структурой (от изопропила до изоамила). Оказалось, что по мере удлинения алкоксильных радикалов эффективность хинолизидиновых ФОИ по отношению к АХЭ млекопитающих, как правило, возрастала, в то время как в случае АХЭ мухи эффект был обратным. Известно, что при другой структуре отщепляющейся части молекулы ФОИ с увеличением объема фосфорильной группы чувствительность АХЭ млекопитающих проявляла тенденцию к снижению [2, 3].
Продолжением анализа эффекта структуры фосфорильной группы является представленное в табл. 2 сопоставление антихолинэстеразной эффективности изомерных неразветвленных и разветвленных алкоксифосфорных производных. Здесь существенным оказалось строение алкок-сильных радикалов: для пропил-изопропильных пар ФОИ (соед. II и V, IX и XII) сказалось преиму-
R = C2H5 (I); R = C3H7 (II); R = C4H9 (III); R = C5H11 (IV); R = i-C3H7 (V); R = i-C4H9 (VI); R = i-C5H11 (VII)
R = C2H5 (VIII); R = C3H7 (IX); R = C4H9 (X); R = C5H11 (XI); R = i-C3H7 (XII); R = i-C4H9 (XIII); R = i-C5H11 (XIV)
Таблица 1. Эффективность (1§кп) тестированных фосфорорганических ингибиторов по отношению к ацетилхо-линэстеразам (АХЭ) разных животных и к бутирилхолинэстеразе (БХЭ) сыворотки крови лошади
Источники ферментов
Ингибиторы АХЭ БХЭ сыворотки крови лошади
эритроцитов человека эритроцитов кролика мозга мыши голов комнатной мухи
I 4.34 4.04 4.32 8.53 7.38
II 5.18 4.88 4.56 8.08 7.48
III 5.55 5.40 5.56 7.46 7.77
IV 5.76 4.72 4.08 6.36 8.11
V 4.00 4.21 2.90 6.40 6.65
VI 5.20 5.32 4.45 7.08 7.08
VII 6.67 5.58 5.48 6.53 8.52
VIII 4.30 4.89 4.38 7.04 6.68
IX 5.58 5.65 5.15 7.28 6.78
X 6.28 5.55 5.61 6.23 7.78
XI 6.26 5.55 5.61 6.66 8.00
XII 4.15 4.73 4.08 7.15 6.51
XIII 6.73 5.08 5.85 6.28 6.85
XIV 6.85 5.75 6.08 6.79 7.67
Таблица 2. Сопоставление антиацетилхолинэстеразной эффективности изомерных неразветвленных и разветвленных алкоксифосфорных производных лупинина и эпилупинина
Источники ферментов
Ингибиторы АХЭ БХЭ сыворотки
эритроцитов эритроцитов мозга голов крови лошади
человека кролика мыши комнатной мухи
II — V 15 5 45 50 10
III — VI 1 1 10 1 5
IV — VII 1/10 1/10 1/25 1 1
IX — XII 100 10 35 1/5 30
X — XIII 1 5 1 1 10
XI — XIV 1/5 1 1/5 1 1
щество неразветвленных алкоксифосфорных производных вне зависимости от структуры хиноли-зидиновой отщепляющейся группировки. С удлинением алкоксильных радикалов (например, для амил-изоамильных пар ФОИ — соед. IV и VII, XI и XIV) тенденция изомерного эффекта изменилась до противоположной.
Таблица 3 представляет данные для наиболее существенной структурной проблемы настоящего исследования: важно ли для проявления анти-холинэстеразной эффективности оксиальное (лупининовые производные — соед. I—VII) или экваториальное (эпилупининовые производные — соед. VIII—XIV) взаимное расположение хиноли-зидинового бицикла и фосфорильной группировки. На стадии сорбции молекулы ФОИ в районе каталитического центра ХЭ обе части молекулы играют определенную роль, причем, видимо, бо-
лее важна сорбция непланарного хинолизидино-вого бицикла, однако нельзя игнорировать влияние на "продуктивное" расположение молекулы эффектора от
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.