ОНТОГЕНЕЗ, 2011, том 42, № 4, с. 307-311
ГЕНЕТИКА РАЗВИТИЯ ^
УДК 575.16:581.44:573.22
РАЗЛИЧНОЕ ВЛИЯНИЕ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНА APETALA1 НА РАЗВИТИЕ РЕПРОДУКТИВНЫХ ОРГАНОВ В ЦВЕТКАХ МУТАНТА abruptus Arabidopsis thaliana (L.) HEYNH.1 © 2011 г. У. Н. Кавай-оол, Е. В. Куприянова*, Т. А. Ежова*
Тывинский государственный университет 667000 Кызыл, ул. Ленина, д. 36 Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН 119991 Москва, ул. Губкина, д. 3 *Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119992 Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 E-mail: arabidopsis2004@mail.ru Поступила в редакцию 19.10.09 Окончательный вариант получен 25.02.10
Ген A. thaliana APETALA1 (АР1) кодирует белок MADS-белок типа II с доменами MADS, I, K и C. Роль К- и С-доменов в функционировании белка АР1 исследована недостаточно. Анализ феноти-пического проявления мутаций, нарушающих активность разных доменов белкового продукта, позволяет получать информацию о функции доменов, а, значит, и о структурно-функциональной организацию гена. Нами проведено изучение влияния на морфологию цветка мутанта abr (аллель гена ABRUPTUS/PINOID) мутантных аллелей гена АР1, белковые продукты которых предположительно лишены функционально активного домена К (ар1-20), доменов К и С (ар1-1 и ар1-6), домена С (ар1-3). Обнаружено, что в отличие от ар1-20, аллели ар1-3, ар1-6и ар1-1 приводят к редукции числа генеративных органов в цветках двойных мутантов abr ap1-3, abr ap1-6и abr ap1-1. Высказано предположение, что С-домен белка АР1 предотвращает нарушение детерминации типа репродуктивных органов при эктопической экспрессии гена АР1 во внутренних мутовках цветка мутанта abr.
Ключевые слова: развитие цветка, взаимодействие генов APETALA1 и ABRUPTUS/PINOID, мутанты, Arabidopsis thaliana.
ВВЕДЕНИЕ
Развитие органов цветка — сложный процесс, который начинается с этапа детерминации типа органов и следующего за ним этапа разметки их положения (Скрябин и др., 2006). У модельного растения A. thaliana тип органов цветка определяется экспрессирующимися в перекрывающихся участках флоральной меристемы гомеозисными генами АВС-классов. Продукты генов А-класса APETALA1 и APETALA2 (АР1 и АР2) детерминируют развитие чашелистиков и, взаимодействуя с продуктами генов В-класса APETALA3 и PISTILLATA (АР3 и PI), — лепестков. Ген С-классаAGAMOUS (AG) детерминирует репродуктивные органы внутренних мутовок, причем при развитии тычинок белок AG взаимодействует с белками АР3 и PI (Coen, Meyerowitz, 1991).
Ген АР1 кодирует MADS-ген типа II, продукт которого содержащие домены MADS, I, K и C (Mandel et al., 1992). Функциональная специфич-
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований.
ность белка АР1 в регуляции развития органов околоцветника определяется главным образом MADS- и I-доменами, причем MADS-домен участвует в связывании с ДНК и, вместе с I-доме-ном, в димеризации MADS-белков. Домены К и С также важны для функционирования АР1, хотя их роль менее ясна (Krizek, Meyerowitz, 1996). К-домен участвует в димеризации ряда MADS-белков и/или стабилизации взаимодействия между ними, однако его функция в димеризации АР1 не является обязательной (Riechmann et al., 1996). С-домен белка АР1 в ситеме in vitro проявляет функцию транскрипционного активатора (Cho etal., 1999). Недавно показано также, что С-до-мен АР1 участвует в образовании комплекса с белками SEUSS (SEU) и LEUNIG (LUG), который репрессирует транскрипцию AG в наружных мутовках, обеспечивая нормальное развитие околоцветника (Sridhar et al., 2006).
Место положения органов цветка определяется скоплением локальных концентраций ауксина, которые создаются благодаря активности генов, контролирующих полярный транспорт ауксина, в том числе гена ABRUPTUS/PINOID
307
5*
308
КАВАЙ-ООЛ и др.
(ABR/PID), кодирующего серин-треаниновую протеинкиназу (Christensen et al., 2000). Ген ABR/PID комплементарно взаимодействует с геном АР1 при образовании чашелистиков и лепестков и ограничивает транскрипцию гена АР1 органами околоцветника. В цветках мутанта abr ген АР1 экспрессируется не только в околоцветнике, но и в репродуктивных органах. Цветки двойного мутанта abr ар1-1 практически не имеют околоцветника и характеризуются существенной редукцией числа репродуктивных органов. Предполагается, что редукция числа тычинок и плодолистиков связана с нарушением определения типа органов во внутренних мутовках из-за эктопической транскрипции мутантного аллеля в репродуктивных органах двойного мутанта (Ка-вай-оол и др., 2010).
В данной работе продолжено изучение влияния мутантных аллелей гена АР1 на развитие репродуктивных органов цветка мутанта abr и приведены результаты изучения структуры цветка еще трех двойных мутантов abr ap1-3, abr ap1-6 и abr ap1-20. Показано, что редукция репродуктивных органов в цветке не наблюдается только в цветках двойных мутантов, содержащих аллель ар1-20 с функционально активным С-доменом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал и анализ морфологии цветка. В работе использовали мутанты abr (линия К-150, полученная на основе расы Dijon-M) и ap1-20 (линия К-200) из коллекции кафедры генетики МГУ, а также мутанты ap1-3 и ap1-6 из коллекции Arabidopsis Biological Resource Centre (http://arabidopsis.org/abrc/), которые трижды скрещивали с растениями расы Dijon-M для получения однородного генотипического фона. Двойные мутанты, получали от скрещиваний мутанта abr с растениями аллельных мутантов ap1-20, ap1-3 и ap1-6. Анализ проводили на 5-ти нижних цветках растений двойных мутантов поколений F3—F5, выращенных в условиях теплицы. Среднее число органов цветка рассчитывали на выборке из 10 растений, анализируя с 1-го по 5-й цветки на главном цветоносе. Сканирующее электронное микроскопирование проводили как описано ранее (Ондар и др., 2008).
Анализ последовательности ДНК
и кДНКгена АР1 у мутанта ap1-6
Выделение ДНК проводили из соцветий дикого типа и мутанта ap1-6 (по Dellaporta et al., 1983, с модификациями). Для амплификации ДНК использовали следующие праймеры: 5'-GCTCAT-TGATGGACTCGTACA-3', 5'-CTTATTGCACCT-GAGTCCGA-3'. Для выделения РНК использовался RNA Easy KIT фирмы QIAGEN с дополнительной обработкой ДНКазой с помо-
щью RNase-Free DNase Set (Qiagen, Германия). Обратную транскрипцию проводили с использованием набора cDNA Synthesis Kit (first strand) с 15T праймером (Silex, Россия). Для выявления альтернативно сплайсированных форм проводили ПЦР-анализ полученной кДНК с использованием следующей пары праймеров: 5'-CATCT-TCTTGATACAGACCACCCAT-3' и 5'-GTATAA-CAGGCTTAAGGCTAAGATTGAG-3'.
Положение праймеров указано на рис. 2. Продукты ПЦР анализировали в агарозном геле (рис. 3) Анализ проводили в 2-х повторностях. Полученные после амплификации фрагменты ДНК и кДНК очищали, клонировали в pAL-TA вектор и далее секвенировали. Секвенирование последовательностей клонированных ПЦР-про-дуктов проводилось в ЦКП "Геном".
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Цветки исходных одиночных мутантов характеризуются изменением числа органов околоцветника. В цветках мутанта abr среднее число чашелистиков ниже (3.0), а лепестков — выше (5.3), чем у дикого типа (по 4 органа в I и II-ой мутовке). Мутанты ap1-3, ap1-6 и ap1-20 имели сниженное число органов во I-ой и II-ой мутовках (рис. 1а). В цветках двойных мутантов редукция органов околоцветника, которые были представлены в основном листьями и брактеями (как и у одиночных мутантов ар1), выражена сильнее, чем в родительских формах (рис. 1а). Эти данные находятся в соответствии с выявленной ранее редукцией органов околоцветника у двойного мутанта abr ap1-1 (Кавай-оол и др., 2010) и подтверждают вывод о комплементарном взаимодействии генов АР1 и ABR/PID в контроле развития околоцветника.
Отметим, что во II-ой мутовке у всех двойных мутантов среди единичных органов преобладали лепестки и лепесткоподобные органы, доля которых была выше, чем у исходных одиночных мутантов (рис. 1а). Даже у ранее исследованного abr ap1-1 лепестки, которые вообще не развивались у одиночного мутанта ар1-1, составляли 16% от всех органов (рис. 1б). Эти данные свидетельствуют о частичном восстановлении в цветках двойного мутанта функции определения типа органов околоцветника гена АР1, которое связано главным образом с функциональной активностью MADS и I доменов (Krizek, Meyerowitz, 1996; Riechmann et al., 1996) и, по-видимому, объясняется выявленным ранее усилением экспрессии этого гена при нарушении работы гена ABR (Ка-вай-оол и др., 2010).
Наиболее интересные отличия между двойными мутантами наблюдали по числу репродуктивных органов. Как и у ранее изученного мутанта abr ap1-1, у abr ap1-3и abr ap1-6наблюдали редукцию числа тычинок и плодолистиков не только по сравнению с мутантами ар1 (у ар1-20 несколь-
1.8 1.5 1.2 0.9 0.6 0.3 0
6 5 4 3 2 1 0
(а)
I мутовка
ap1-6 abr ap1-3 abr ap1-20 abr ap1-6 ap1-3 ap1-20
□ Листоподобные □ Другие III мутовка
1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0
II мутовка
ap1-6 abr ap1-6
ap1-3 abr ap1-3
ap1-20 abr ap1-20
□ Лепестки ПЛепесткоподобныеП Другие IV мутовка
ap1-6 abr ap1-3 abr ap1-20 abr ap1-6 abr ap1-3 abr ap1-20 abr
ap1-6 ap1-3 ap1-20 ap1-6 ap1-3 ap1-20
□ Тычинки □ Филаменты □ Другие (б)
1000 цш 60 х 4 цш 100 цш
I_I I_I I_I
Рис. 1. Структура цветка двойных и одиночных мутантов А. ШаНапа.
а — Среднее число и тип органов цветка в Г—1У мутовках у одиночных и двойных мутантов. Пунктиром на нижних рисунках обозначено среднее число органов в цветках мутанта аЬг. В IV мутовке показано число плодолистиков. б — Цветки двойных мутантов: слева аЬг ар1-1 (виден нормально развитый лепесток, аномальный пестик и 3 тычинки), в центре аЬг ар1-20 (околоцветник отсутствует, 5 тычинок, пестик из 2-х плодолистиков) и справа аЬг ар1-6 (филамен-топодобный орган, 2 тычинки и аномальный пестик).
ко снижено число тычинок по отношению к дикому типу, у ар1-3 и ар1-6 редукции репродуктивных органов не наблюдается), но и по сравнению с мутантом аЬг (рис. 1а, б). Наименьший уровень редукции наблюдали у двойных мутантов по мягкому аллелю ар1-3, средний — по аллелю ар1-6, а наибольший выявле
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.