ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2012, том 444, № 5, с. 567-571
= ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 57.014, 57.044
РАЗЛИЧНОЕ ВЛИЯНИЕ а- И у-ГЛИЦИНА НА АБЕРРАНТНУЮ АКТИВНОСТЬ ПИРАМИДНЫХ НЕЙРОНОВ
В СРЕЗАХ ГИППОКАМПА
© 2012 г. И. А. Малахин, A. Ф. Ачкасов, А. С. Ратушняк, Т. А. Запара, A. Л. Маркель, E. В. Болдырева, академик В. В. Болдырев
Поступило 26.01.2012 г.
В настоящее время в литературе активно обсуждается проблема различной биологической активности полиморфных модификаций одних и тех же соединений, причем природа наблюдаемых различий остается, в общем, неясной [1]. Одной из интересных систем является простейшая аминокислота — глицин (С1у), для которого известно существование нескольких полиморфных модификаций, резко различающихся своими физическими свойствами [2]. Экзогенный С1у широко используется для корректировки дисбаланса возбудительной и тормозной нейрональ-ной активностей, однако исключительно в виде его а-полиморфной модификации.
В работе [3] впервые исследовано биологическое действие у-полиморфной модификации глицина. Показано, что она обладает значительно более высокой биологической активностью, чем а-форма, в отношении влияния на поведение крыс линии с генетической предрасположенностью к каталепсии. Такие крысы используются в качестве биологической модели для изучения некоторых форм патологического поведения, характерных для негативной симптоматики у больных шизофренией. Прием у-С1у, в частности, приводил к резкому уменьшении времени каталептических реакций, снижению реакции страха при попадании в новую обстановку и усилению исследовательской мотивации. Причины этого нового и не исследованного ранее эффекта разли-
Институт цитологии и генетики
Сибирского отделения Российской Академии наук,
Новосибирск
Конструкторско-технологический институт вычислительной техники
Сибирского отделения Российской Академии наук, Новосибирск
Новосибирский национальный исследовательский государственный университет Институт химии твердого тела и механохимии Сибирского отделения Российской Академии наук, Новосибирск
чия биологической активности полиморфных модификаций Gly остаются неясными. В работе [3] глицин (в кристаллической форме) вводился с пищей в организм животных. Было совершенно не очевидно, сохранится ли различие биологической активности полиморфных модификаций глицина после приготовления их растворов, и как проявятся различия активности не на организ-менном, а на клеточном (нейронном) уровне. Для ответа на поставленные вопросы как наиболее адекватный был выбран широко распространенный метод, основанный на регистрации интегральных характеристик нейронов в срезах гип-покампа.
Нами было сопоставлено влияние растворов, приготовленных из двух форм глицина, на активность пирамидных нейронов поля СА1 срезов гиппокампа мыши (ICR). Были получены принципиально важные результаты, показавшие, что различия в биологической активности двух полиморфных модификаций глицина и в виде раствора сохраняются на клеточном уровне и не являются следствием метаболических модификаций в организме. Эти результаты излагаются и обсуждаются в настоящей работе.
Глицин фирмы "Союзхимреактив", представлявший собой смесь а- и у-модификаций, пере-кристаллизовывали для получения чистых в фазовом отношении полиморфных а- и у-модифика-ций. у-Глицин получали по двум альтернативным методикам: с использованием аммиака [4] или яблочной кислоты [5]. Образцы характеризовали при помощи рентгенофазового анализа (дифрак-тометр Bruker D8-GADDS, СиК"а-излучение, X = = 1.54184 Ä, Hi-STAR двухкоординатный детектор), ИК-спектроскопии (спектральный диапазон 4000—600 см-1, разрешение 4 см-1, ИК-Фурье спектрометр Excalibur 3100 с приставкой НПВО ATR MIRacle, Pike) и хроматографически (Мил-лихром AO-2). ИК-спектры снимали без какой-либо предварительной пробоподготовки и без разбавителя, чтобы исключить возможное влияние растворителя на фазовый состав в процессе
567
7*
Рис. 1. Пример записи нейрональной активности в зоне CA1 гиппокампа, вызванной снятием магниевого блока с ионных каналов HMDA-рецепторов.
приготовления образца к исследованию. Размер частиц в образцах а- и y-Gly (конгломераты 50— 70 мкм из частиц 1—20 мкм) контролировали при помощи оптической и сканирующей электронной микроскопии.
Эксперименты проводили на срезах гиппокампа самцов мышей линии ICR (возраст 2 мес.). Извлеченный после декапитации мозг переносили в охлажденный до 4° С физиологический раствор. Через одну минуту выделяли гиппокамп и с помощью механического микротома делали поперечные срезы толщиной 350—400 мкм. Срезы помещали в камеру с проточным (скорость потока 1.5 мл/мин) аэрируемым карбогеном (95% О2, 5% СО2) физиологическим раствором следующего состава (мМ): NaCl - 129, KCl - 2.25, CaCl2 -2.4, MgSO4 - 2.5, NaHCO3 - 26, KH2PO4 - 1.2, глюкоза - 10, pH 7.6-7.8. Температуру в камере в течение 60 мин медленно повышали до 32° С.
Внеклеточная регистрация вызванной и спонтанной суммарной электрической активности в пирамидном слое области СА1 выполнялась с помощью стеклянного микроэлектрода, заполненного физиологическим раствором. Для регистрации вызванной активности пирамидных нейронов проводили стимуляцию коллатералей Шаффера стеклянными микроэлектродами.
Исследования действия а- и у-форм глицина на активности пирамидных нейронов проводили в физиологическом растворе без MgSO4 (Mg0-раствор). Эксперимент включал четыре периода перфузии: физиологическим раствором (1 ч); Mg0-раствором; Mg0-раствором c глицином; Mg0-раствором для отмывания глицина. Обе формы глицина растворяли в Mg0-растворе непосредственно перед использованием в концентрации 1 мМ [6]. Количественные данные представлены в виде средних величин ± стандартное отклонение.
В физиологическом растворе в пирамидном слое области СА1 спонтанная активность нейронов отсутствует и ее появление является отклонением от нормы. Рецептор-канальный комплекс типа Н-метил-В-аспартат (НМВА) глутаматных рецепторов в физиологических растворах потен-циалзависимым образом заблокирован ионами магния. Использование безмагниевого раствора снимает блок с ионного канала НМВА-рецепто-ра. Это приводит к появлению аберрантной спонтанной активности пирамидных нейронов, опосредованной НМВА-рецепторами [7, 8], и позволяет проводить сравнение влияния Иу на спонтанную активность пирамидных нейронов гиппокампа (рис. 1). На клеточном уровне глицин, как тормоз-ный медиатор, может компенсировать такие экспериментально созданные нарушения.
Через 15—20 мин после начала перфузии раствором в зоне СА1 регистрировалась спонтанная активность, опосредованная НМВА-рецеп-торами (рис. 1), интенсивность которой по мере перфузии увеличивалась. Спустя 60—90 мин частота разрядов спонтанной активности стабилизировалась. Регистрировали в среднем 12 ± 7 разрядов в минуту. После этого начинали перфузи-ровать срезы М^0-раствором, содержащим 1 мМ а- или у-Иу.
Динамика изменения спонтанной активности пирамидных нейронов поля СА1 срезов, вызванная а- или у-И1у, представлена на рис. 2. Обе формы глицина оказывали влияние на частоту генерации и амплитуду разрядов. В начальный период перфузии эффект глицина проявлялся в увеличении частоты разрядов (рис. 2а, б). а-И1у (п = 10) в этот период (4—6 мин) вызывал 1.5-2-кратное, а у-И1у (п = 10) 3—4-кратное увеличение частоты спайков. В дальнейшем обе формы глицина вызывали уменьшение амплитуды разрядов (рис. 2а, б).
Динамика спада амплитуды, вызываемая а- и у-формами глицина, имела значительные отли-
РАЗЛИЧНОЕ ВЛИЯНИЕ а- И у-ГЛИЦИНА
569
у-глицин
I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_|_
10 11 12 13 14 15 16 17 мин
(б)
Время, мин 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
(в)
а-глицин
I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I
012345678 мин
□ а-, ■ у-глицин
Рис. 2. Примеры записи активности в зоне СА1 гиппокампа при воздействии а- и у-форм глицина. а — во время действия раствора М£0 + у-глицин. б — во время действия раствора М£0 + а-глицин. в — средняя продолжительность времени развития модулирующего действия а- и у-глицина.
0
чия. Период, в течение которого происходило уменьшение электрической активности пирамидных нейронов, при действии раствора а-С1у продолжался в среднем 8 ± 4 мин от начала перфузии. При действии раствора у-С1у этот период был более продолжительным, в среднем 31 ± ± 10 мин (рис. 2в). Эффект раствора у-С1у не зависел от способа получения этой полиморфной
модификации — по "аммиачному" или по "яблочно-кислотному" методам. Перфузия срезов М§0-раствором, не содержащим глицин, восстанавливала амплитуду и частоту импульсной активности.
Таким образом, растворы обеих форм глицина оказывали характерные для этого медиатора/ко-
фактора воздействия на нейроны поля СА1 гип-покампа. Воздействие глицина на ИМЭА-рецеп-торы проявлялось в увеличении частоты разрядов (рис. 2а, б). Такая реакция нейронов обусловлена потенцирующим действием глицина, вызывающим увеличение частоты открывания катионного канала этого рецептора [6]. Уменьшение амплитуды разрядов пирамидных нейронов (рис. 2а, б) указывает на снижение возбудимости нейронов, вызванное взаимодействием глицина со своими специфическими рецепторами [9].
Различия эффектов двух форм глицина проявляли во временной динамике модулирующего влияния на активность пирамидных нейронов срезов гиппокампа (рис. 2). Блокада спонтанной активности пирамидных нейронов поля СА1 при действии растворов у-И1у в сравнении с растворами его а-формы отличалась большей продолжительностью. Известно, что снижение возбудимости нейронов, маскирующее модулирующее влияние глицина на катионные ИМВА-каналы, обусловлено взаимодействием глицина со своими специфическими рецепторами, активирующими анионные (хлорные) каналы [6]. Полученные данные указывают, что в случае применения у-И1у его модулирующий эффект на ИМЭА-ка-налы проявляется более длительный период. По литературным данным, с одной стороны, потенцирующее действие И1у (<10 нМ) на ИМЭА-ре-цепторы проявляется в увеличении частоты открывания катионного канала этого рецептора, проницаемого для ионов к
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.