БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2009, том 26, № 4, с. 280-286
УДК 577.352.4
РАЗЛИЧНЫЙ МЕХАНИЗМ БЛОКАДЫ 9-АМИНОАКРИДИНОМ ИОННЫХ КАНАЛОВ NMDA- И АМРА-РЕЦЕПТОРОВ
© 2009 г. О. И. Барыгин, Н. В. Лучкина, В. Е. Гмиро*, Д. Б. Тихонов
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, пр. М. Тореза, д. 44,194223, Санкт-Петербург; тел.: (812) 552-31-38; факс: (812) 552-30-12; электронная почта: denistikhonov2002@yahoo.com *Институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург Поступила в редакцию 24.02.2009 г.
Трициклические моно- и дикатионные соединения (производные 9-аминоакридина) являются блокато-рами каналов NMDA- и АМРА-рецепторов. В представленной работе сопоставлены особенности механизмов блокады NMDA- и АМРА-каналов 9-аминоакридином и его производными. Эксперименты проведены методом локальной фиксации потенциала на нейронах, изолированных из срезов головного мозга крысы. Важной особенностью действия 9-аминоакридина на каналы NMDA-рецепторов является крутая концентрационная зависимость, предполагающая связывание двух молекул в канале. При блокаде АМРА-каналов 9-аминоакридин также демонстрирует ряд особенностей. Его действие не зависит от потенциала на мембране, что свидетельствует о поверхностной локализации участка связывания. К тому же его дикатионный аналог не проявляет большую активность, что характерно для классических ка-налоблокаторов - производных адамантана и фенилциклогексила. Можно заключить, что 9-аминоакридин и его производные связываются со специфическим сайтом в АМРА-рецепторе. Это открывает возможность разработки принципиально нового семейства неконкурентных антагонистов АМРА-рецепторов.
Ключевые слова: синаптическая передача, АМРА, NMDA, рецепторы, ионные каналы, блокада.
Постсинаптические рецепторы глутамата, опосредующие проведение возбуждающего сигнала в глутаматергических синапсах, делятся на два основных класса - КМБА и АМРА по действию избирательных агонистов [1]. Каналы КМБА-рецепторов высокопроницаемы для кальция [2], но при потенциале покоя эффективно блокируются внеклеточным магнием [3, 4]. Снятие магниевого блока происходит при деполяризации, например, за счет активации АМРА-рецепторов. Кальциевая проницаемость АМРА-рецепторов зависит от их субъединичного состава (умеренная для в1иК2-несодержащих рецепторов и пренебрежимо малая для в1иК2-содержащих рецепторов) [5]. Таким образом, деполяризующий сигнал на постсинаптической мембране, равно как и кальциевый сигнал, зависят от сочетания рецепторов разных типов в синапсе.
Разработка эффективных и клинически толерантных нейропротекторов антиглутаматного действия наталкивается на ряд проблем, связанных с неполной селективностью блокирующего действия и с разнообразием механизмов блокады ионных каналов [6]. Например, действие большинства катионных блокаторов потенциал-зависимо, оно ослабляется при деполяризации, т.е. блокатор эффективно действует при потенциале
покоя, ингибпруя спнаптпческую передачу. А при деполяризации, например, глутаматом в высокой концентрации, эффективность блокады падает. Понятно, что такие блокаторы, несмотря на их высокую активность in vitro, вряд ли эффективны в физиологических условиях.
Один из интересных классов блокаторов NMDA-каналов - 9-аминоакридин, такрин и их производные. Связывание этих соединений в канале препятствует закрытию ворот и диссоциации агониста [7-10]. В результате происходит смещение равновесия в реакции активации канала, и блокирующее действие становится зависимым от концентрации агониста. Блокаторы такого типа представляются перспективными, поскольку их действие усиливается при высоких (потенциально токсичных) концентрациях глутамата [11]. Основные структурные детерминанты действия аминоакридина и его производных на NMDA-каналы были недавно изучены [12, 13]. Оказалось, что плоская структура сопряженных ароматических циклов является необходимым условием того, что связывание блокатора препятствует закрытию канала. Этот результат открывает путь к разработке новой серии перспективных антагонистов глутаматных рецепторов.
9-Аминоакридин блокирует преимущественно NMDA-каналы [12], однако его действием на АМРА-каналы нельзя пренебречь. Производные аминоакридина могут быть менее избирательны в отношении подтипов глутаматных рецепторов. Еще одной побудительной причиной к проведению данного исследования послужило то, что аминоакридин, как сказано выше, имеет необычный механизм блокады NMDA-рецепторов: он препятствует закрытию канала. Представлялось вероятным, что действие этого соединения на АМРА-каналы может также иметь свои особенности. В ходе исследования выявлены некоторые особенности блокады АМРА-каналов 9-аминоак-ридином.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Крыс линии Вистар (возраст 13-18 дней) дека-питировали под уретановым наркозом. Мозг быстро извлекали и охлаждали до 2-4°С. Затем на вибратоме "Campden Instruments" (Великобритания) приготавливали поперечные срезы стриа-тума и гиппокампа толщиной 200-300 мкм, которые сохраняли в растворе (мМ): NaCl - 124, KCl -5, CaCl2 - 1.3, MgCl2 - 2, NaHCO3 - 26, NaH2PO4 -1.24, D-глюкоза - 10. Раствор аэрировали карбо-геном (95% 02, 5% С02), рН 7.4-7.5, при 24-26°С. Нейроны, экспрессирующие определенный вид глутаматных рецепторов, изолировали из срезов методом вибродиссоциации [14] через 2 ч и более после их приготовления. Для исследования NMDA-каналов выбирали пирамидные нейроны, выделенные из поля CA1 гиппокампа, а для исследования AMPA-рецепторов - гигантские интернейроны стриатума. Пирамидные нейроны гиппокампа идентифицировали по морфологическим признакам. Наряду с этими признаками, при идентификации интернейронов стриатума проверяли их чувствительность к ИЭМ-1460, избирательному блокатору AMPA-каналов, лишенных субъединицы GluR2 [15].
Для регистрации трансмембранных токов применяли метод локальной фиксации потенциала. Микропипетку заполняли раствором (мМ): CsF -100, CsCl - 40, NaCl - 5, CaCl2 - 0.5, EGTA - 5, HEPES - 10 (pH доводили до 7.2 с помощью CsOH). Внеклеточный раствор содержал (мМ): NaCl - 143, KCl - 5, CaCl2 - 2.5, D-глюкоза - 18, HEPES - 10 (pH доводили до 7.4, добавляя HCl). При исследовании AMPA-рецепторов во внеклеточный раствор добавляли MgCl2 в концентрации 2 мМ. Рецепторы активировали аппликацией соответствующих агонистов глутамата: NMDA-ре-цепторы - NMDA (30 мкМ) в присутствии глицина (10 мкМ); AMPA-рецепторы - каинатом (100 мкМ). Для аппликации применяли систему быстрой замены растворов [16]. Регистрацию проводили в конфигурации "целая клетка" c по-
мощью усилителя EPC-8 "HECA Elektronik" (Германия). Контроль мембранного потенциала, управление системой аппликации, регистрацию и анализ данных осуществляли с помощью компьютера.
Использовали реактивы фирмы "Sigma" (США). Все результаты представлены как среднее ± стандартное отклонение в серии как минимум пяти экспериментов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Концентрационная зависимость блокады. В
более ранних исследованиях было показано, что коэффициент Хилла, наблюдаемый при блокаде NMDA-каналов 9-аминоакридином и такрином, существенно больше единицы. Это свидетельствует о том, что в канале могут связываться, по крайней мере, две молекулы данного блокатора. Однако аппроксимация концентрационной зависимости блокады по уравнению Хилла не дает информации о механизме блока. Ранее А. Соболевский [10] предложил модель, в которой с каналом NMDA-рецептора последовательно связываются две молекулы 9-аминоакридина, причем связывание уже одной молекулы обеспечивает блок канала. Этот вывод сделан на основании анализа кинетики взаимодействия 9-аминоакридина с каналом. В настоящей работе проведен подробный анализ концентрационной зависимости блокады 9-аминоакридином равновесных токов, вызванных NMDA. Результат представлен на рис. 1. Видно, что наклон концентрационной кривой немонотонный, нижняя часть хорошо аппроксимируется при коэффициенте Хилла, равном 1, в то время как действие высоких концентраций соответствует коэффициенту Хилла, близкому к 2. Именно такой ход концентрационной кривой типичен для схемы последовательного связывания. Расчет ингибирования тока согласно этой модели производится с помощью уравнения (1). Преимущество этой модели связывания можно продемонстрировать количественно. Величина ошибки аппроксимации по методу наименьших квадратов уравнением Хилла составляет 125% от ошибки аппроксимации уравнением (1). Важно отметить, что как уравнение Хилла, так и уравнение (1), содержат два варьируемых параметра, т.е. лучшая аппроксимация уравнением (1) достигается без увеличения числа варьируемых параметров. В отличие от уравнения Хилла, параметры уравнения (1) имеют очевидный физический смысл констант связывания двух молекул 9-аминоакридина с каналом.
I/10 = -1-Г—. (1)
1 + [ В ]/К1 + [ В ]7К2
• ММБЛ-каналы
■ Са^+проницаемые ЛМРЛ-каналы ▲ Са -непроницаемые ЛМРЛ-каналы
I 10
0.001
1 10 100 1000 Концентрация 9-ЛЛ, мкМ
ММБЛ (50 мкМ)
500 пА
1с
КЛ (100 мкМ)
150
1с
КЛ (100 мкМ)
9-аминоакридин (1 мМ)
500 пА
9-аминоакридин (300 мкМ)
1с
При исследовании концентрационной зависимости блокады Са2+-проницаемых и Са2+-непрони-цаемых АМРА-каналов существенных отклонений коэффициента Хилла от 1 замечено не было (рис. 1, таблица). Таким образом, уже из анализа концентрационной зависимости блокады следует важное различие в действии 9-аминоакридина на КМБЛ- и АМРА-каналы: в КМБЛ-канале последовательно связываются две молекулы, а в АМРА-каналах - только одна.
Потенциал-зависимость блокады. 9-Ами-ноакридин является классическим потенциал-зависимым блокатором КМБЛ-каналов. Исходя из классической теории потенциал-зависимости блока [17], можно определить глубину залегания сайта связывания в поле мембраны (величина г8). Для 9-аминоакридина глубина залегания сайта связывания в поле мембраны составляет, как и у многих блокаторов КМБЛ-каналов, 0.6-0.8 [12]. Однако эти данные получены исходя из уравнения Хилла. Аппроксимация по уравнению (1) дает возможность определить заглубленность обоих сайтов связывания в поле мембраны. При -80 мВ К1 = 30.0 ± 4 мкМ, К2 = 513 ± 8 мкМ, а при -40 мВ К1 = 95 ± 5 мк
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.