БИОЛОГИЯ ВНУТРЕННИХ ВОД, 2014, № 2, с. 82-88
УДК 597.5:579.25:579.26
РАЗНООБРАЗИЕ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ СЛИЗИСТОЙ И СОДЕРЖИМОГО КИШЕЧНИКА РЫБ ОЗ. ЧАНЫ (ЗАПАДНАЯ СИБИРЬ)
© 2014 г. Е. Н. Кашинская*, Е. В. Суханова**, М. М. Соловьев*, Г. И. Извекова***, В. В. Глупов*
*Институт систематики и экологии животных СО РАН, 630091 Новосибирск, ул. Фрунзе, 11, e-mail: elena.kashinskaya@inbox.ru **Лимнологический институт СО РАН, 664033 Иркутск, ул. Улан-Баторская, 3 ***Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, 152742 пос. Борок, Ярославская обл., Некоузскийр-н Поступила в редакцию 13.06.2013 г.
Исследовано разнообразие микробных сообществ, ассоциированных со слизистой оболочкой и содержимым кишечника рыб с разной пищевой специализацией. С помощью групп-специфичных праймеров на основные крупные таксоны бактерий установлены различия в составе кишечной микробиоты у рыб с разным типом питания. Филумы Planctomycetes, Vferrucomicrobia и Cyanobacte-ria отмечены в содержимом кишечника всех исследованных мирных (серебряный карась, плотва, елец) и хищных (судак, щука, окунь) рыб. В слизистой и содержимом кишечника хищных видов рыб в отличие от мирных зарегистрирован филум Firmicutes.
Ключевые слова: рыбы, микробиота кишечника, филогенетическое разнообразие.
Б01: 10.7868/80320965214020041
ВВЕДЕНИЕ
Водная среда обитания представляет собой открытую систему, в которой гидробионты постоянно взаимодействуют с микроорганизмами, присутствующими в толще воды, в донных отложениях, а также ассоциированными с объектами питания [13]. Процессы микробной колонизации кишечника при питании, как правило, приводят к установлению симбиотических взаимоотношений между организмом-хозяином и микробиотой. Кишечная микробиота играет важную роль в обеспечении защитных функций организма, процессах пищеварения у рыб и регуляции общего метаболизма. Показано, что бактерии, продуцируя различные антибактериальные вещества, препятствуют колонизации кишечника патогенными микроорганизмами [24]. Кишечная микробиота вырабатывает набор ферментов, обеспечивающих гидролиз белков, жиров и углеводов, входящих в состав объектов питания рыб; участвует в деградации таких сложных молекул как целлюлоза, хитин и коллаген, как правило, недоступных для ферментов хозяина [13]. Кишечная микробиота синтезирует ряд витаминов, в частности витамин В12, необходимый для роста и развития рыб [31].
Состав и численность микроорганизмов в пищеварительном тракте зависит от влияния различных параметров: факторов окружающей среды, возраста, типа и режима питания рыбы, отдела пищеварительного тракта и др. [5]. Среди этих параметров тип питания оказывает наиболее существенное влияние на таксономический состав кишечной микробиоты рыб [32].
Рыбы сильно различаются по характеру потребляемой пищи. Каждый вид рыб приспособлен к питанию определенным кормом. Спектр пищевых ресурсов обусловливает разнообразие кишечной микробиоты [10]. По типу питания рыб принято делить на растительноядных, плотоядных и всеядных. Также по предпочитаемым кормовым объектам рыб разделяют на эврифагов, планктофагов, бентофагов, ихтиофагов и других [5, 27].
Наряду с микробиологическими подходами для анализа кишечной микробиоты рыб широкое распространение получили молекулярно-генети-ческие методы, позволяющие наиболее полно определить структуру и филогенетическое разнообразие бактерий. Молекулярная идентификация отдельных бактериальных таксонов основана на амплификации фрагмента гена 16S рРНК с ис-
пользованием консервативных праймеров на домен Eubacteria и последующим секвенированием или использованием специфических праймеров на филогенетические группы разного таксономического уровня.
Подобные исследования на территории России ведутся спорадически. Хорошо исследованы микробные сообщества, ассоциированные с ло-сосевидными рыбами оз. Байкал и некоторых водоемов Восточной Сибири [9]. Микробное сообщество кишечника рыб с разным типом питания на территории Новосибирской области с помощью молекулярной идентификации изучено впервые.
В последние годы достаточно подробно исследована активность пищеварительных ферментов рыб оз. Чаны на ранних этапах онтогенеза [8]. Однако их кишечная микробиота остается неисследованной.
Цель работы — сравнить состав кишечной микробиоты ихтиофагов и условно "мирных" рыб оз. Чаны методом полимеразной цепной реакции с использованием спектра специфичных праймеров.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Отбор проб и выделение ДНК. Материал собирали на территории эстуарной части оз. Малые Чаны (нижнее течение р. Каргат) в июне 2011 г.
Озеро Чаны — бессточное, мелководное, эв-трофное озеро Западно-Сибирской низменности, расположенное на территории Новосибирской обл. [7, 12]. Площадь водосборного бассейна 29.930 тыс. км2, величина акватории (2004 г.) 1500 км2, глубины на разных участках колеблются от 1.4—1.9 м (юго-восточная часть озера) до 4.8— 8.5 м (оз. Яркуль) [3]. В оз. Чаны и впадающих в него реках Каргат и Чулым обитают 15 видов рыб. Наибольшую долю промысловых уловов в озере составляют плотва, язь и окунь [6]. Во время отбора проб средняя температура воды была 23—26°C. Глубина водоема в местах отбора варьировала от 0.3 до 1.5 м.
В работе использованы сеголетки (0+) шести видов рыб. Мирные: серебряный карась Carassius auratusgibelio (Bloch, 1782) (общая длина L= 80.3 ± ± 28.1 мм, масса Q = 2.3 ± 0.5 г), плотва сибирская Rutilus rutilus (Linnaeus, 1758) (L = 46.5 ± 6.9 мм, Q = 1.0 ± 0.5 г), елец сибирский Leuciscus leuciscus (Linnaeus, 1758) (L = 59.4 ± 5.4 мм, Q = 1.7 ± 0.5 г). Ихтиофаги: окунь речной Perca fluviatilis (Linnaeus, 1758) (L = 58.8 ± 2.3 мм, Q = 1.7 ± 0.7 г), обыкновенный судак Stizostedion lucioperca (Linnaeus, 1758) (L = 76.7 ± 15.6 мм, Q = 3.5 ± 2.1 г), обыкновенная щука Esox lucius (Linnaeus, 1758) (L = 383 мм). Рыб отлавливали мальковым бреднем (размер ячеи 6 мм). Затем в течение 1 ч живых рыб в пла-
стиковых контейнерах (V = 20 л) с водой доставляли в лабораторию. Рыб умерщвляли, перерезая позвоночник позади головы, измеряли стандартную длину и массу тела. Кожные покровы рыб освобождали от слизи ватным тампоном, дезинфицировали спиртом и с помощью стерильных инструментов разрезали брюшную полость и извлекали кишечный тракт.
Слизистую оболочку кишечника и его содержимое анализировали отдельно. ДНК выделяли с использованием коммерческих наборов на сорбентах - ДНК-сорб В и ДНК-сорб С (МФГУН ЦНИИ Эпидемиологии, Россия) согласно протоколу, с небольшими модификациями. Лизат клеток центрифугировали, надосадочную жидкость использовали для выделения ДНК.
Амплификация фрагмента гена 16S рРНК бактерий. В состав реакционной смеси (объем 10 мкл) для проведения полимеразной цепной реакции входили следующие компоненты: 1 х ПЦР буфер (рН 8.8), 2.5 мМ MgCl2, 1 мМ дНТФ (смесь), двапраймера (по 10 пмоль каждого), Taq ДНК-полимераза (1 ед. акт.).
Для амплификации использовали следующие пары праймеров: 500F-1350R (Eubacteria); 109L-958R (Euryarchaeota); 333F-958R (Eur-yarchaeota); 27F-B-K1R (Firmicutes); 338F-B-K1R (Firmicutes); LGC353F-1542R (Firmicutes); 27F-685R (Alphaproteobacteria); 35F-685R (Al-phaproteobacteria); 35F-1542R (Alphaproteobacte-ria); 359F-682R (Betaproteobacteria); 352F-920R (Planctomycetes); 540F-1542R (Chlamydiae/Verru-comicrobia); 106F-500R (Cyanobacteria); 106F-785R (Cyanobacteria) [2].
Режим для амплификации (амплификатор "БИС" М-111-05) был следующим: предварительная денатурация матрицы (ДНК) (94°С) — 3 мин (1 цикл); денатурация матрицы (94°С) — 45 с, отжиг праймеров (58°С) — 45 с, элонгация (72°С) — 1 мин (35 циклов); постэлонгация (72°С) — 3 мин (1 цикл).
Продукты амплификации детектировали с помощью электрофореза в 1.5%-ном агарозном геле в 1 х ТАЕ с добавлением этидиум бромида. Ам-пликоны визуализировали в ультрафиолетовом свете на трансэлюминаторе (ECX-26.MX).
Статистическая обработка данных. Для сравнения состава микробиоты слизистой и содержимого кишечника, а также состава микробиоты ихтиофагов и мирных рыб использовали коэффициент сходства Серенсена, который изменяется от нуля (нет сходства) до единицы (полное сходство) [33]. Для построения дендрограмм использовали метод Joining tree clustering (древовидная кластеризация), реализованный в программе STATISTICA 6 (StatSoft®, Richmond, USA).
Таблица 1. Разнообразие филогенетических групп бактерий, ассоциированных с содержимым и слизистой кишечника рыб с разным типом питания
Филогенетическая группа Серебряный карась Плотва Елец Судак Щука Окунь
Содержимое кишечника
Euryarchaeota + - - + - +
Firmicutes - - - + + +
Alphaproteobacteria + - + - + -
Betaproteobacteria + + + - - +
Planctomycetes + + + + + +
Vferrucomicrobia + + + + + +
Cyanobacteria + + + + + +
Слизистая кишечника
Euryarchaeota + + + + - +
Firmicutes - - + + + +
Alphaproteobacteria + - + - + -
Betaproteobacteria + + + + - +
Planctomycetes + + + + - -
Verrucomicrobia - - + + + +
Cyanobacteria + + + - + +
Примечание. " + " — присутствие, " — " — отсутствие.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Разнообразие микробиоты слизистой и содержимого кишечника мирных и хищных рыб. В содержимом кишечника для всех исследованных мирных рыб и ихтиофагов отмечены филумы Plancto-mycetes, Verrucomicrobia и Cyanobacteria (табл. 1). Вариации наблюдали в детекции представителей эубактерий филумов Proteobacteria (класс Al-phaproteobacteria) и Planctomycetes, а также архе-бактерий филума Euryarchaeota. Основное различие отмечено в составе микробиоты содержимого кишечника мирных рыб, где бактерии филума Firmicutes не зарегистрированы.
При исследовании состава микробиоты слизистой кишечников наблюдаются другие особенности. У всех мирных видов рыб обнаружены архе-бактерии Euryarchaeota, представители филумов Planctomycetes и Cyanobacteria, а также класса Be-taproteobacteria, у ихтиофагов — Firmicutes и Ver-rucomicrobia. Не обнаружено филума бактерий, общего для всех изученных видов рыб (табл. 1).
Наибольшее разнообразие бактерий в содержимом кишечника получено для серебряного карася и окуня, наименьшее — для плотвы. Для слизистой кишечника
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.