УДК 577
РАЗОБЩАЮЩИЕ БЕЛКИ UCP2 И UCP3 МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ И МЫШЦ СУСЛИКА Spermophilus undulatus В ОТЛИЧИЕ ОТ UCP1 БУРОГО ЖИРА НЕ СПОСОБНЫ К НЕСПЕЦИФИЧЕСКОМУ ТРАНСПОРТУ
ПИРУВАТА
© 2013 г. Н. П. Комелина, З. Г. Амерханов*
Институт биофизики клетки РАН, 142290, Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 3;
*электронная почта: amerkhanov@mail.ru Поступила в редакцию 07.05.2013 г.
Функциональная роль митохондриальных разобщающих белков, гомологов ИСР1 из бурой жировой ткани, остается неясной. Недавно предположили, что у животных ИСР2 и ИСР3 действуют как метаболические триггеры, способные переключать углеводный метаболизм на жировой, откачивая пируват из митохондрий. Мы проверили данную гипотезу, используя в качестве объекта зимоспя-щих сусликов 8регторЫ1т ипйиШт, у которых в зимний период повышается содержание ИСР в тканях, и присутствует ИСР1 в развитой бурой жировой ткани. Нами подтверждена принципиальная возможность неспецифического транспорта пирувата с участием ИСР1 в митохондриях бурой жировой ткани, предпринята попытка идентифицировать такой транспорт в митохондриях печени и скелетных мышц сусликов. Показано, что в препаратах митохондрий из бурого жира можно наблюдать транспорт пирувата, опосредованный ИСР1, по ОВР-чувствительному набуханию митохондрий, индуцированному валиномицином в 55 мМ калиевой соли пирувата. В аналогичных условиях в препаратах митохондрий печени и скелетных мышц зимних сусликов мы не обнаружили сколько-нибудь заметный электрогенный транспорт анионов пирувата, который можно связать с функционированием ИСР2 и ИСР3. В то же время, электронейтральный транспорт пирувата, осуществляемый классическим мито-хондриальным переносчиком пирувата, регистрируется по набуханию в пирувате калия, индуцированному валиномицином или нигерицином, и ингибируется его специфическим ингибитором а-СНС. Таким образом, нами показано, что в митохондриях печени и скелетных мышц зимних сусликов ИСР2 и ИСР3 не способны транспортировать пируват в отличие от ИСР1 из бурой жировой ткани.
Ключевые слова: биоэнергетика, митохондрии, разобщающие белки, транспорт пирувата.
DOI: 10.7868/S0233475513050071
В настоящее время известен целый ряд митохондриальных белков-разобщителей (uncoupling proteins, UCP), обнаруженных у представителей самых разных таксономических групп. У млекопитающих многие периферические ткани содержат разобщающий белок UCP2 (печень, почки, селезенка и другие ткани), исключительно для скелетных мышц характерен UCP3, а в ткани головного мозга обнаружены UCP4 и UCP5 [1, 2]. Первым среди белков этого семейства был изучен термогенин, UCP1. Этот белок специфичен для митохондрий бурого жира, он необходим для генерации тепла при несократительном термогене-зе при адаптации животных к низким температурам [3, 4]. UCP1 рассеивает электрохимическую энергию, транспортируя протоны с внешней стороны мембраны на внутреннюю. Предполагают, что это происходит благодаря механизму циклического переноса жирных кислот. При этом UCP1 выносит анионы жирных кислот, а их протониро-ванная форма возвращается обратно через бис-
лойную мембрану, суммарно приводя к переносу протона, рассеиванию протонного градиента и, следовательно, к разобщению окислительного фосфорилирования [5, 6].
Гомологи иСР1 представляют очевидный интерес в силу их широкого распространения и изменения уровня синтеза в тканях в зависимости от различных физиологических состояний. С момента открытия иСР1 прошло около 10 лет, проведено множество исследований, однако конкретные функции до сих пор не установлены [1, 2]. Содержание различных гомологов иСР1 в митохондриях тканей гораздо ниже, чем содержание иСР1 в митохондриях бурого жира. Их транспортные свойства изучали в основном на искусственных мембранах, при этом использовали ре-комбинантные белки, полученные путем экспрессии в микроорганизмах. Было показано, что эти белки повторяют биохимические свойства "родоначальника" данного семейства, активируются, как и иСР1, жирными кислотами, ин-
гибируются пуриновыми нуклеотидами и переносят некоторые анионы [7]. Функции белков UCP часто связывают с их разобщающими свойствами. Высказываются различные предположения о возможных физиологических функциях, такие например, как защита от активных форм кислорода, удаление пероксидов, транспорт жирных кислот и другие. При этом гипотезы и данные экспериментов часто оказываются противоречивыми [1,2, 9]. Если ранее функцией гомологов UCP1 считали разобщение окислительного фос-форилирования для образования тепла в других тканях помимо бурого жира, то к настоящему времени накапливается все больше данных о том, что они не участвуют в терморегуляции. В частности, нами показано, что в разогреве животного при выходе из спячки эти белки не принимают участия [9]. Более того, нам, как и некоторым другим исследователям, в экспериментах на изолированных препаратах митохондрий не удалось обнаружить проявлений функциональной активности UCP2 и UCP3, которую можно было бы связать с их разобщающими свойствами [10, 11].
Недавно была выдвинута гипотеза [12, 13], согласно которой UCP2, UCP3 и, возможно, другие разобщающие белки выполняют роль метаболического триггера, присутствие которого в мито-хондриальной мембране позволяет переключать метаболизм с углеводного на преимущественно жировой. Эту функцию они осуществляют, активно транспортируя (откачивая) анионы пиру-вата из митохондрий за счет разности электрохимического потенциала ионов водорода (ДцН), препятствуя тем самым утилизации пирувата митохондриями. Это предположение основывано на сопоставлении данных об изменении уровня мРНК UCP2 в различных условиях и особенностях метаболизма культуры клеток с повышенной экспрессией UCP2 [13]. В зависимости от доступности питательных веществ, глюкозы или жирных кислот клетка регулирует метаболизм митохондрий и использует либо гликолиз, либо окислительное фосфорилирование для получения энергии. В отсутствие UCP2 клетка переключается на использование глюкозы, что стимулирует пролиферацию. Увеличение экспрессии UCP2, например при голодании, коррелирует с возрастанием окисления жирных кислот, при этом лимитируется использование пирувата, образуемого в процессе гликолиза. Экспорт пирувата из митохондрии в цитозоль через UCP2, по мнению авторов, может обеспечивать наблюдаемые эффекты. Данная гипотеза основана на данных о том, что UCP1 способен транспортировать различные одновалентные однополярные анионы, в том числе и пируват, путем их электрогенного переноса по градиенту мембранного потенциала [14, 15]. Транспорт всех анионов, включая пируват, ингибировался GDP и, в меньшей степени, другими пуриновыми нуклеотидами. Тогда пред-
полагалось, что физиологическая роль транспорта монокарбоксилатов через иСР1 заключается в их способности осуществлять, подобно жирным кислотам, футильный цикл, приводящий к снижению потенциала на мембране и рассеиванию энергии в виде тепла [15].
Гибернирующие животные — уникальный объект для исследования адаптации к экстремальным условиям среды, при которой наблюдаются значительные перестройки метаболизма. Метаболизм животного, находящегося в зимней спячке, подобен метаболизму голодающего, с преобладанием окисления жиров для получения энергии [16]. Также в зимний период у сусликов увеличивается концентрация разобщающих белков иСР2 и иСРЗ [17], что указывает на участие этих белков в адаптации организма к холоду и их вовлеченности в механизмы, обеспечивающие состояние гибернации. Для якутских сусликов БрегторкИт ипйиШт подобные результаты получены и нами [10]. Кроме того, эти животные имеют развитую бурую жировую ткань, содержащую активно функционирующий и хорошо изученный иСР1 в митохондриях.
Используя в данной работе зимоспящих животных, мы попытались обнаружить транспорт пирувата в митохондриях печени и скелетных мышц, что можно было бы связать с активностью белков иСР2 и иСРЗ и, тем самым, подтвердить или опровергнуть предложенную в работе [12] схему функционирования этих белков в качестве триггера, способного переключать метаболизм клетки с углеводного на жировой. Для этого предполагалось подтвердить принципиальную возможность неспецифического транспорта пирува-та с участием иСР1 в митохондриях бурой жировой ткани, а затем выявить подобный транспорт пирувата в митохондриях печени и скелетных мышц, чтобы его можно было связать с активностью белков иСР2 и иСРЗ в этих тканях у зимних, адаптированных к холоду, сусликов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы и экспериментальные животные.
В экспериментах использовали длиннохвостых сусликов Б. ипйиШт. Животных отлавливали в Якутии в летний период и содержали в специально приспособленных подвальных помещениях с температурой 1—5°С. Период гибернации, который длится с октября по март, не непрерывный, он состоит из периодически повторяющихся бау-тов спячки (2—3 нед), когда животное находится в состоянии глубокого торпора (температура тела 3— 4°С), активных межбаутных состояний (1—2 дня) (температура тела 37°С), а также входа (8—12 ч) и выхода из спячки (3—4 ч). Для исследования предложенной выше гипотезы были выбраны зимние активные межбаутные суслики. В этот период животное интенсивно использует запасы
организма для поддержания активного состояния, отсутствует характерное для спящих животных подавление метаболизма на уровне митохондрий [18, 19], интенсивно используется несократительный термогенез с участием UCP1 в бурой жировой ткани [3, 4]. Межбаутных животных в активном состоянии брали в условиях их естественного пробуждения при температуре окружающей среды 1—5°С. Температура тела активных животных в момент забоя путем декапитации составляла 37°С. Животных предварительно подвергали легкому эфирному наркозу. В работе использовали реактивы фирмы Sigma-Aldrich (США) и отечественные соли квалификации не ниже ч. д. а. Раствор пирувата калия готовили из натриевой соли пирувата (Sigma-Aldrich) путем ионообменной хроматографии на смоле Dowex 50wx8 (Serva, Германия) в Н+-форме с последующей нейтрализацией раствора пировиноградной кислоты с помощью КОН до pH 7.2.
Выделение митохондрий. Митохо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.